Purificación y caracterización espectroscópica de BLUF46, uno de los fotorreceptores putativos tipo BLUF del patógeno humano Acinetobacter nosocomialis

A.M. LOTO; P.C. JAIME; M. A. MUSSI; C.D. BORSARELLI; I. ABATEDAGA

SC Bariloche

Congreso; IV REUNIÓN DE FOTOBIÓLOGOS MOLECULARES ARGENTINOS (IV GRAFOB); 2018

GRAFOB

Los dominios BLUF (Blue Light sensing Using FAD) son fotorreceptores cuyo cromóforo es FAD. Pueden intercambiar de forma reversible desde un estado oscuro, dBLUF, a un estado señalizador, sBLUF, por excitación con luz azul [ , ]. Estos dominios son ampliamente estudiados ya que proporcionan una extensa fuente de plantillas moleculares para la ingeniería de proteínas fluorescentes, biosensores y herramientas optogenéticas [ ]. Acinetobacter nosocomialis es un patógeno oportunista, que presenta en su genoma 3 regiones que codifican para dominios putativos BLUF [ ], a los cuales denominamos BLUF46, BLUF65 y BLUF85. En este trabajo se expresó de manera heteróloga uno de los fotorreceptores putativos presentes, BLUF46. El mismo se purificó con dos variantes de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y de exclusión en gel. Las espectroscopías de régimen estacionario (absorción y emisión UV-Vis) revelaron que la proteína obtenida, responde ante estímulos de luz azul, y que presenta características similares a las pertenecientes a la familia BLUF. Se demostró que entre el rango entre 13°C y 32°C, BLUF46 muestra el fotociclo característico, con un progresivo deterioro en la eficiencia del proceso para temperaturas mayores a 28°C. Asimismo, los resultados de fluorescencia dinámica, TCSPC, sugieren que posterior a los 24°C, la temperatura impacta sobre la interacción cromóforo-entorno, en especial el residuo de Tyr8, modificando las condiciones estructurales necesarias para la fotoactivación. Se determinó la energía de activación para la formación de ambos estados de la proteína, siendo el proceso activado por luz prácticamente independiente de la temperatura, pero no así la relajación en oscuridad que se activa con aproximadamente 50 kJ/mol. Finalmente, BLUF 46 mostró capacidad de recuperar su funcionalidad fotoinducida posterior al calentamiento, a lo que denominamos reversibilidad, hasta T ≤ 32°C. Estos resultados indican el delicado balance estructura-actividad con la temperatura para este tipo de BLUFs