Optimización de una técnica de extracción de ARNs pequeños en muestras de plasma seminal para su potencial uso como biomarcadores.

ZOFF, L; CARBONARO, M; PEREZ, M; SPINELLI, S.V.; CALVO, K; SERPA, I

Congreso; XVIII Congreso y XXXVI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario. Rosario; 2016

La infertilidad afecta al 15% de la población mundial y el factor masculino está involucrado en aproximadamente la mitad de los casos. En la actualidad, se cuentan con escasas técnicas de diagnóstico eficaces, precisas y no invasivas que permitan caracterizar en profundidad la infertilidad masculina lo que conduce a una dificultad en el abordaje de los tratamientos de reproducción asistida. Es por esta razón, que sería de gran utilidad la identificación de nuevos biomarcadores en plasma seminal, entre los cuales los ARNs pequeños constituyen un buen candidato. Estas moléculas se han detectado en varios fluidos humanos, y se ha encontrado que sus perfiles de expresión están alterados en diversas patologías humanas. Asimismo, son altamente estables y su cuantificación es sencilla y altamente reproducible. En este marco, el presente trabajo se enfoca en la puesta a punto de una técnica de detección de ARNs pequeños a partir de muestras de plasma seminal. Para ello, se evaluaron distintas variantes del protocolo tradicional de extracción de ARN con TRizol, dada las altas concentraciones de polisacáridos y proteínas presentes en las muestras en estudio. Concretamente, se probaron distintas formas y tiempos de precipitación, como así también se evaluó el efecto del PEG 20K en la remoción de polisacáridos. Para validar la presencia de ARN en las muestras, se procedió a la amplificación de 4 ARNs pequeños previamente descriptos en la bibliografía (piRNA 575660, piRNA 597348, let-7 y miR-29) mediante la técnica de stem?loop RT- qPCR. Los distintos protocolos fueron analizados y comparados teniendo en cuenta la coprecipitación de contaminantes, evaluada por medidas de absorbancia a 270nm, y el rendimiento, evaluado en función de los valores de Ct obtenidos en la qPCR. El protocolo que logró optimizar estas variables es el que introduce un pretratamiento con PEG 20K y emplea como precipitante una mezcla de isopropanol frío con una solución salina (0.8 M citrato de sodio - 1,2 M NaCl), y un tiempo de precipitación de 2h a -20°C. Los resultados obtenidos empleando esta técnica permitieron la detección de ARNs pequeños en un amplio rango dinámico, encontrándose los piARNs en mucha mayor concentración que los miARNs (Cts ~ 26 para piRNAs vs Cts ~ 32 para let-7) y garantizan la obtención de muestras de ARN de alta calidad para futuros estudios poblacionales de identificación de potenciales biomarcadores con utilidad diagnóstica en enfermedades reproductivas masculinas.