Expresión exacerbada del antígeno D. Estudio serológico y molecular

LUJÁN BRAJOVICH M; TRUCCO BOGGIONE C; ENSINCK A; MATTALONI S; RACCA L; BIONDI C; COTORRUELO C

Rosario

Congreso; XVII Congreso y XXXV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2015

Sociedad de Biología de Rosario

El antígeno D del sistema de grupo sanguíneo Rh está compuesto por un mosaico de epitopes que se localizan en dominios extracelulares de la proteína RhD del glóbulo rojo (GR). La determinación rutinaria del fenotipo D se realiza en base a técnicas de hemaglutinación, perfectamente estandarizadas. Uno de los parámetros que deben considerarse durante el proceso de tipificación del antígeno D es el tiempo transcurrido desde la unión del anticuerpo hemoclasificador con la suspensión eritrocitaria hasta la aparición o no del aglutinado. Las reacciones fuertemente positivas antes de los 10 segundos o débilmente positivas posteriores a los 120 segundos sugieren una expresión aberrante de los epitopes D. La caracterización molecular de estas variantes D es de fundamental importancia en hemoterapia ya que permite decidir la conducta transfusional adecuada. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las bases moleculares responsables de un fenotipo con sobreexpresión del antígeno D. Se estudió una muestra que durante la tipificación de rutina en placa reaccionó fuertemente (intensidad ++++, único aglutinado) con el reactivo anti-D antes de los 2 segundos de iniciada la reacción. Se determinó el fenotipo Rh completo de la muestra en estudio mediante técnicas de hemaglutinación en tubo. Posteriormente se investigó la expresión de los antígenos D, C, c, E y e por citometría de flujo. En todos los casos se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-D (clon MS201), anti-C (clon MS24), anti-c (clon MS33), anti-E (clones MS80 + MS258) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). Para los estudios de citometría de flujo se utilizó además un anticuerpo anti-μ marcado con APC. Muestras de GR R1R2 y GR negativos para los distintos antígenos estudiados fueron analizadas como controles. Se investigó la estructura molecular del gen RHCE analizando distintos sitios polimórficos específicos por estrategias de biología molecular basadas en PCR-SSP y PCR-RFLP. Los estudios de hemaglutinación en tubo y citometría de flujo no detectaron expresión de los antígenos C, c, E ni e sugiriendo que la muestra presenta un fenotipo con deleción parcial de los antígenos Rh (fenotipo D--). Por otro lado, el análisis por citometría de flujo demostró una exacerbada expresión del antígeno D respecto de los GR R1R2. El valor de la mediana de la intensidad de fluorescencia correspondiente a la muestra en estudio fue de 12204, mientras que el promedio obtenido de los controles positivos analizados fue de 8898. Los estudios moleculares revelaron la ausencia de secuencias RHCE específicas en un fragmento génico comprendido entre el exón 2 y el exón 7 del gen RHCE. Se identificaron polimorfismos RHCE específicos correspondientes al exón 1, 9 y a la región 3´UTR. Estos datos sugirieron que la muestra en estudio es portadora de un alelo híbrido RHCE(1-2)-D(3-8)-CE(9-10) en estado homocigota en el cual un segmento de ADN de un alelo RHD se ha insertado en un alelo RHCE por un evento de conversión génica entre secuencias homólogas de los genes RHD y RHCE. La presencia de secuencias RHD específicas a lo largo de casi toda la nueva estructura recombinante sería la responsable de la elevada expresión del antígeno D detectada en la muestra del paciente portador de esta variante alélica.