DETECCIÓN DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 EN MUESTRAS AGRUPADAS POR PCR DIGITAL

HECKEL SOFIA; PETRELI MARIA VICTORIA; SESMA JULIANA; PACINI ANTONELLA; PAREDES FRANCO; ADRIANI NATALIA; IBARRA GUADALUPE; PEREZ MARILINA

Rosario

Congreso; Reunión Anual (Sociedad de Biología de Rosario); 2022

Una de las aplicaciones más importantes de la PCR digital en gotas (ddPCR) es ladetección de mutaciones raras (RMD). El reto es la diferenciación entre dos secuenciasmuy similares, una significativamente más abundante que la otra. En este caso, ladetección de una variante de SARS-CoV-2 presente en una baja frecuencia en un medioconteniendo altas concentraciones de virus salvaje (WT). Esto es posible debido a que laddPCR particiona la muestra en 20.000 nanogotas por tubo, aumentando la concentraciónrelativa de la variante en defecto. Esto da por resultado una mayor sensibilidad y mayorresistencia a inhibidores. Nuestro laboratorio ya validó el uso de ddPCR para la detecciónde SARS-CoV-2 en muestras agrupadas combinando hasta 34 muestras. Teniendo encuenta que continúan surgiendo nuevas variantes de interés (VOI) y preocupación (VOC)del SARS-CoV-2, es importante monitorear su circulación a través de la vigilanciagenómica. Nuestro objetivo es demostrar la viabilidad de diferenciarlas trabajando conmuestras agrupadas a fin de reducir los tiempos de análisis y los costos. Para eso se utilizóel panel de mutación TaqMan SARS-CoV-2 de ThermoFisher tanto para la RT como parala ddPCR para diferenciar las variantes. Las pruebas se realizaron desde julio de 2021hasta marzo de 2022 con muestras anónimas. Las muestras fueron seleccionadas a partirde su análisis inicial por RT-PCR. A las muestras positivas se las genotipificoindividualmente mediante RT-qPCR. Finalmente, se eligió una muestra para la varianteomicrón y otra para delta y se las agrupó con muestras WT en pooles de diferentestamaños (1 variante en un grupo de 4, 10 o 15 muestras WT) y se las analizó por ddPCR.Los datos se analizaron con el software de análisis Quanta Soft (Bio-Rad). Un resultadonegativo de la prueba indica que ningún individuo del grupo tiene la variante que seanaliza, mientras que un resultado positivo indica que al menos un individuo del grupo espositivo para esa variante. En el caso de detectarse pooles positivos, se abre ese pool y seanalizan las muestras individualmente por RT-PCR. En el presente trabajo demostramosque es posible identificar una variante delta u omicron en pooles de hasta 10 muestras porddPCR. Los estudios de sensibilidad y especificidad se realizaron siguiendo loslineamientos de la Farmacopea Europea. Este ensayo presenta una sensibilidad del 100% (n=24) y una especificidad >98 % (n=50). Por lo tanto, informamos sobre una nuevatecnología de diagnóstico para la detección de variantes de SARS-CoV-2 en poolesmediante ddPCR para lograr resultados rápidos (< 24 hs), con alto rendimiento y bajos costos