Utilización de flagelina de Salmonella para aumentar el potencial adyuvante de partículas derivadas de la pared celular de Lactococcus lactis que expresan antígenos de rotavirus

SILVESTRE D.; MANDILE, M. G.; RUMBO, M.; SILVESTRE D.; MANDILE, M. G.; RUMBO, M.; ARGÜELLES, M. H.; GLIKMANN, G.; TEMPRANA, C. F.; ARGÜELLES, M. H.; GLIKMANN, G.; TEMPRANA, C. F.; MORENO, G.; PERI IBAÑEZ, E.S.; CASTELLO, A.; MORENO, G.; PERI IBAÑEZ, E.S.; CASTELLO, A.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2019); 2019

Asociación Argentina de Microbiología

Los rotavirus son los principales agentes etiológicos de gastroenteritis severa en niños menores de cinco años a nivel mundial. Aunque la vacunación ha logrado reducir los índices de mortalidad, aún continúa la búsqueda de alternativas vacunales más eficaces y seguras, particularmente libres de virus con capacidad replicativa. Lactococcus lactis ha sido estudiado como plataforma de delivery de antígenos, siendo el sistema de expresión inducido por nisina (NICE) uno de los más utilizados. Recientemente, nuestro grupo logró expresar en L. lactis la proteína VP6 de rotavirus dejándola expuesta en la superficie celular, aunque dicho L. lactis recombinante administrado por vía de mucosas no indujo una respuesta humoral específica. Por el contrario, cuando se administraron por vía intranasal partículas derivadas de la pared (CWDP) de dichos L. lactis conteniendo VP6 se logró una respuesta inmune específica anti-rotavirus. Sin embargo, la misma solo confirió protección frente a la infección cuando las CWDP fueron coadministradas con un adyuvante. Dado que la flagelina ha sido propuesta como un adyuvante de mucosas debido a su capacidad para activar receptores del sistema inmune como el TLR5, el objetivo del presente proyecto fue aumentar la inmunogenicidad de las CWDP utilizando una variante delecionada de la flagelina (FliC) de Salmonella enterica. Por un lado, se propuso expresar FliC en L. lactis y por otro, generar una proteína de fusión entre FliC y VP6 fusionando sus secuencias codificantes mediante SOE-PCR. Para ello, el ORF de FliC o el de la fusión FliC-VP6 fueron expresados en L. lactis NZ9000 utilizando el sistema NICE.La expresión de ambas proteínas se evaluó mediante SDS-PAGE en distintas condiciones de inducción. Posteriormente se obtuvieron las CWDP correspondientes y se estudió la presencia de las proteínas recombinantes en la pared mediante SDS-PAGE. Para confirmar la identidad de las mismas se realizaron ensayos de western blot utilizando anticuerpos anti-rotavirus y anti-flagelina. Por último, su capacidad para activar el receptor TLR5 fue evaluada in vitro utilizando la línea celular reportera Caco-CCL20-Luc.Los resultados muestran que los mayores niveles de expresión de FliC y FliC-VP6 se obtienen con 30 ng/ml y 60 ng/ml de nisina, respectivamente, a una temperatura de 25 °C, aunque la cantidad obtenida de FliC-VP6 fue considerablemente menor. Finalmente, en las condiciones ensayadas in vitro, sólo las CWDP conteniendo FliC lograron activar el receptor TLR5.En este trabajo se lograron obtener CWDP derivadas de L. lactis conteniendo FliC que poseen la capacidad de activar TLR5 in vitro. Se planea estudiar su potencial como adyuvante en un contexto de inmunización por vía de mucosas in vivo. Para ello se evaluará en un modelo murino la respuesta inmune anti-rotavirus luego de su coadministración, por vía intranasal, con las CWDP conteniendo VP6.