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NOVELES AMIDAS Y HETEROCICLOS CON ACTIVIDAD ANTICONVULSIVA Laureano L. Sabatier, a Pablo H. Palestro,a Andrea V. Enrique,b Valentina Pastore,b Pedro Martín,b Luciana Gavernet.*a a Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Bioactivos, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, 47 y 115, La Plata B1900BJW, Argentina. b Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos (IIFP, CONICET?Universidad Nacional de la Plata), Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. La Plata B1900BJW, Argentina lls@biol.unlp.edu.ar Introducción. La Epilepsia es una enfermedad neurológica caracterizada por crisis recurrentes, provocadas por una actividad neuronal anómala, que suelen dar lugar a consecuencias neurobiológicas, cognitivas, psicológicas y sociales.1 De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud más de 50 millones de personas en el mundo sufren Epilepsia.2 Si bien la terapia farmacológica es el método más empleado de tratamiento, alrededor de la mitad de los pacientes informan al menos un efecto adverso durante el tratamiento con antiepilépticos (FAEs) de primera línea y un 30 % presenta resistencia a los mismos. 3 El hecho de que existan pacientes con crisis que no se puedan tratar adecuadamente con los medios disponibles, hace imprescindible la búsqueda de nuevos fármacos que superen la fármaco-resistencia y presenten menores efectos adversos. En este trabajo se presenta la síntesis de una familia de estructuras con un esqueleto de oxatiazolidin-4-ona-2,2-dióxido (figura 1) y sus precursores como nuevos candidatos de FAE. El fundamento para seleccionar este andamio químico se basó en su relación bioisostérica con los FAEs clásicos: fenitoína y trimetadiona.El procedimiento sintético involucró la preparación de las correspondientes αhidroxiamidas (precursoras de los heterociclos) mediante aminólisis de 2-hidroxiisobutil metil éster y la amina correspondiente (Esquema 1).Ambas α-hidroxiamidas (1) y sus correspondientes derivados heterocíclicos (3) se evaluaron frente a la prueba de inducción de convulsiones por vía eléctrica (MES test) en ratones. La toxicidad también se testeó mediante la prueba estandarizada de Rotorod, que se incluye en la fase primaria de detección anticonvulsiva programa. Al observarse actividad en los compuestos ensayados se iniciaron los estudios de su posible modo de acción. Para ello, se analizó la capacidad de las estructuras para bloquear la isoforma del canal sodio Nav1.2 (blanco molecular de muchos FAEs). Primero, se simuló la interacción entre los compuestos y un modelo 3D de la isoforma Nav1.2 mediante docking molecular. Luego, se validaron las predicciones sobre corrientes Na1.2 empleando la técnica de electrofisiología patch clamp. Resultados Síntesis de 2-hidroxiisobutil-amidas N-sustituidas. Las α-hidroxiamidas 1 (R1y R2 ) se sintetizaron por amonolisis de 2-hidroxiisobutil metil éster (Esquema 1), en condiciones libres de solventes y con calentamiento asistido por microondas (MW). En estas condiciones, los rendimientos fueron del 45% y 40% respectivamente. Síntesis de N-derivados-5,5-dimetiloxatiazoli-dine-4-ona-2,2-dioxidos. La reacción de ciclación de las α-hidroxiamidas para obtener los correspondientes heterociclos se llevó a cabo siguiendo las condiciones descritas previamente en el Esquema 1. Inicialmente, se obtuvieron los monóxidos cíclicos a través de la reacción de las amidas con cloruro de tionilo y trietilamina. Luego, los compuestos se oxidaron con NaIO4 y RuCl3 para producir los derivados finales. Los rendimientos de las reacciones fueron 52 % y 58 % respectivamente. Ensayo in vivo. Se evaluaron los cuatro compuestos empleando el ensayo MES. Se siguieron los procedimientos estándares propuestos por el Programa de detección de tratamientos para la Epilepsia (ETSP) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)4 . Los compuestos se administraron a ratones por vía intraperitoneal a las dosis más bajas del programa (30 y 100 mg / Kg), y todos los ensayos se realizaron a las 0,5 y 4 horas. Los 4 compuestos sintetizados (figura 2) demostraron actividad anticonvulsiva a menos de 100 mg/ Kg y no presentaron neurotoxicidad. Estos resultados son alentadores ya que esas condiciones posicionan a los compuestos como candidatos prometedores para continuar con pruebas biológicas sucesivas.Estudios in silico y electrofisiologia. Inicialmente, las moléculas fueron evaluadas en un modelo 3D del canal de sodio en la isoforma Nav1.2 con el software Autodock Vina 5 . Se definió un valor de corte de -8.1 kcal / mol para diferenciar compuestos activos de inactivos. Los resultados sugirieron que las amidas son candidatos más pobres para bloquear el canal Nav1.2 ya que ninguna de ellas pudo superar el valor corte, mientras que la estrategia virtual propuso a los compuestos 3R1 y 3R2 como bloqueantes de Nav1.2. Para proponer el modo de acción de las drogas y validar los resultados del acoplamiento molecular se evaluó la actividad in vitro de los cuatro compuestos en las corrientes de Na+ transportadas a través de la isoforma del canal hNav1.2, expresada de forma estable en células HEK 293 mediante el uso de la configuración de célula completa. Los resultados arrojaron una inhibición en la corriente por parte de los compuestos 3R1 y 3R2 y no así como sus amidas precursoras. Estos resultados son consistentes con las predicciones del modelo de docking. Conclusiones Se obtuvieron cuatro nuevos compuestos con actividad anticonvulsiva en modelo MES. Adicionalmente se demostró la elevada capacidad predictiva del modelo de docking, permitiendo sugerir el mecanismo de acción de las drogas 3R1 y 3R2 . Referencias 1. Pacreu, S. et al. Anaesthesia management in epilepsy surgery with intraoperative electrocorticography. Rev. Esp. Anestesiol. Reanim. 65, 108?111 (2018). 2. Organización Mundial de la Salud. (2018). https://www.who.int/es/newsroom/fact-sheets/detail/epilepsy 3. McCorry, D., Chadwick, D. & Marson, A. Current drug treatment of epilepsy in adults. Lancet Neurol. 3, 729?735 (2004). 4. Kupferberg, J. P. ?The NIH Anticonvulsant Drug Development (ADD) Program: preclinical anticonvulsant screening project,? in Molecular and cellular targets for antiepileptic drugs". (1997) 5. Palestro, P. Búsqueda de nuevos anticonvulsivos a partir de métodos computacionales. (2016).