Desarrollo de un equipo automatizado basado en Resonancia de Plasmones Superficiales: hacia la biodetección de analitos de bajo peso molecular en muestras de agua

COCCO MAURO; AUGUIE BAPTISTE; TOGNALLI NICOLAS; DAZA MILONE MARIA A.; CHAIN YAMIL; RAMIREZ EDUARDO; VELA MARIA ELENA; SALVAREZZA ROBERTO; RUMBO MARTÍN; DOCENA GUILLERMO H.; MONTOYA JORGELINA; FAINSTEIN ALEJANDRO

La Plata

Congreso; Octavo Congreso Argentino Química Analítica; 2015

La toxicidad de pesticidas y herbicidas habitualmente empleados en explotaciones agrícolas y uso doméstico es una cuestión relevante por su impacto en el medio ambiente y la salud pública. En Argentina, uno de los productos más abundantemente usados es el glifosato, lo cual ha motivado la búsqueda de sistemas de monitoreo de su presencia como contaminante en capas freáticas. La detección mediante Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) se basa en cambios en el índice de refracción en un espesor muy cercano a la superficie de un sustrato debido por ejemplo a la adsorción de moléculas (1). Los analitos de bajo peso molecular (típicamente < 1kDa), tal es el caso de las sustancias agroquímicas, no producen un cambio en la señal SPR suficiente para ser detectado y su presencia debe ser revelada a través de ensayos de competencia. En estos ensayos la superficie se derivatiza con el mismo tipo de sustancia a detectar (por ejemplo el analito conjugado a una proteína) y la muestra debe preincubarse con una cantidad fija de la sustancia de biorreconocimiento (por ejemplo un anticuerpo específico para el analito a detectar). De este modo, si no hay analito presente en la muestra, todos los anticuerpos son capaces de unirse a la superficie y se obtiene una señal máxima, mientras que si la muestra contiene una cantidad saturante de analito, ningún anticuerpo podrá interaccionar con la superficie. La curva de sensibilidad y el rango de detección del método dependerá de la concentración de anticuerpo, tiempo de preincubación y cantidad de analito conjugado a proteína en la superficie derivatizada. En este trabajo se describe el diseño y funcionamiento de un equipo portátil basado en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) diseñado para el análisis en tiempo real de analitos de distinta naturaleza. El sistema integra las bombas y válvulas para la inyección de la muestra y regeneración de la plataforma de sensado y un sistema óptico de alineación y automatización. La superficie sensora (sustrato de vidrio con una película delgada de oro) se funcionaliza con monocapas de alcanotioles que permiten su postfuncionalización de acuerdo al analito que se desea detectar. Se utiliza 2,4 dinitrofenol (DNP) como modelo de analito de bajo peso molecular comparable al glifosato y el objetivo es realizar experimentos de calibración con concentraciones conocidas del anticuerpo anti-dinitrofenol (anti-DNP) de modo de definir la concentración adecuada de anticuerpo para los futuros ensayos de competencia. El funcionamiento del dispositivo fue probado modificando el sustrato de oro con el portador BSA-DNP (seroalbúmina bovina conjugada con DNP) El portador y los anticuerpos monoclonales se obtuvieron y purificaron adaptando protocolos ya establecidos (2, cita de IIFP Los sustratos de oro del SPR se modificaron ex?situ con monocapas autoensambladas de ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) que fueron postfuncionalizadas in- situ (dentro del equipo SPR) mediante síntesis covalente. Brevemente, el portador BSA-DNP se conjugó al MUA mediante síntesis amida utilizando los agentes de acoplamiento EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida) , seguido por una desactivación con etanolamina. Los ensayos de reconocimiento entre BSA-DNP inmovilizado y el anti-DNP en soluciones buffer se realizaron mediante pasaje de diluciones sucesivas del anticuerpo partiendo de una concentración de anti-DNP 0.54 mg/ml (Fig. 1). Estos ensayos mostraron un límite de detección (LOD) de 540 ppb de anti-DNP