Modulación de la apoptosis en cultivos celulares heterólogos y homólogos infectados con Herpesvirus equino.

SCROCHI, M.; BRAVI, M.E.; FUENTEALBA, N.; GIMENO, E.; PORTIANSKY, E.; BARBEITO, C.; MUGLIA C.I.; ZANUZZI, C.; GALOSI, C.

Rosario

Congreso; XVI CONGRESO y XXXIV REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2014

La muerte por apoptosis puede actuar como un mecanismo de protección celular frente a la infección por diversos virus. El Herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) es un agente infeccioso que produce signos respiratorios, nerviosos, aborto y síndrome neonatal en equinos. A diferencia de otros alphaherpesvirus, se desconoce si el EHV-1 ejerce acción modulatoria y cuál mecanismo estaría implicado en ella. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto modulatorio de la apoptosis de EHV-1 en cultivos celulares heterólogos y homólogos, durante el ciclo de replicación viral. Se utilizaron células Madin-Darby bovine kidney (MDBK), y cultivo primario de riñón equino, crecidas sobre cubreobjetos con MEM-10% SFB infectadas con la cepa AR8 (MOI=10) y recolectadas a las 3, 9, y 18 hs posinfección (pi). Simultáneamente se realizaron controles de apoptosis (incubación con sorbitol 1M durante 1 h a 37 °C) y controles negativos (sin tratamiento); finalmente, todas las células fueron fijadas con acetona fría. La apoptosis fue evaluada cuantitativamente mediante técnicas de inmunofluorescencia. Las células se incubaron con TUNEL (Roche), específico para detectar la fragmentación del ADN producida por la activación de caspasas efectoras. Paralelamente, un esquema similar de células fue incubado con el anticuerpo M30 CytoDEATH (Roche), específico para determinar el clivaje de la citoqueratina 18 desencadenada por la activación de caspasas efectoras y con un anticuerpo anti-ratón conjugado con el fluorocromo Alexa 488; ambos esquemas fueron incubados con DAPI (4´,6-diamidino-2-fenilindol) para identificar los núcleos celulares. Los cultivos de células fueron observados por medio de microscopía confocal. Los resultados de los índices de apoptosis para cada técnica fueron comparativamente mayores en las células homólogas que en los obtenidos con las células heterólogas, aunque en las dos líneas celulares se observó una similar tendencia. De este modo con la técnica de TUNEL se detectó que el índice de marcación positiva en el grupo infectado a las 9 hs pi fue similar al control negativo para el mismo horario, y significativamente menor que el obtenido a las 3 y 18 hs pi. El porcentaje de clivaje de la citoqueratina 18 obtenido en el grupo infectado a las 9 hs pi fue significativamente menor que el control negativo, mientras que a las 18 hs pi la marcación positiva fue significativamente mayor que a las 9 hs pi y al control negativo. Por lo antes expuesto, el índice de apoptosis sólo fue significativamente menor a las 9 hs pi. Se concluye que la infección por EHV-1 modula la muerte por apoptosis en células homólogas y heterólogas infectadas, un mecanismo que favorecería la replicación viral y podría deberse a la transcripción de los genes tempranos.