SÍNTESIS DE UN BIOSENSOR GENÉTICAMENTE CODIFICADO PARA MEDIR EL POTENCIAL REDOX DE NADP(H) EN PLANTAS

MOLINARI, P.E; KRAPP, AR; BUSTOS-SANMAMED, P; ZURBRIGGEN, M. ; CARRILLO, N.

Rosario

Simposio; Simposio de genómica funcional de plantas; 2017

IBR,UNR

SÍNTESIS DE UN BIOSENSOR GENÉTICAMENTE CODIFICADO PARA MEDIR EL POTENCIAL REDOX DE NADP(H) EN PLANTASMolinari, Pamela E.1,2, Krapp, Adriana R.1,2, Bustos-Sanmamed, Pilar2, Zurbriggen, Matías3 y Carrillo, Néstor1,2.1Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. Maipú 1065 (2000) Rosario, 2IBR-CONICET Argentina, Ocampo y Esmeralda (2000) Rosario, Argentina, 3Inst. Synthetic Biol. Heinrich Heine Univ. Dusseldorf Alemania.email: molinari@ibr-conicet.gov.arLa detección de NADP+/NADPH en organismos vivos es un recurso de gran importancia para la biología. Sin embargo, los métodos disponibles son muy deficientes. roGFP2, GFP sensible a reducción-oxidación, tiene dos máximos de excitación de fluorescencia a 400 y 490 nm y muestra cambios ratiométricos reversibles en la emisión a 510 nm, in vitro e in vivo, en respuesta a los niveles de tioles del medio ambiente. En este proyecto se diseñó un sensor no invasivo para determinar la fracción NADP+/NADPH basado en las propiedades ratiométricas de roGFP2. Consiste de una tiorredoxina específica de NADP(H), la NTRC, unida a roGFP2 a través de un brazo conector. Estas fusiones se expresaron en cepas de Escherichia coli que sobreexpresan chaperones moleculares y se purificaron en columna de afinidad. Las relaciones de fluorescencia, reflejo del estado redox de NTRC-roGFP2, variaron con la concentración de NADPH indicando que NTRC-roGFP2 se equilibra con NADPH y funciona como sensor de este metabolito transduciendo los cambios redox de los piridín nucleótidos al universo de los tioles. El potencial redox de este par se determina de acuerdo al estado de oxidación del sensor por medio de la ecuación de Nernst. En carácter de prueba de concepto, se evaluó in vivo mediante microscopía confocal en células de bacterias y en plantas transformadas transitoriamente. Este biosensor puede ser introducido en células animales y vegetales permitiendo detectar cambios en los niveles de NADP(H) en el tiempo y en el espacio en tejidos vivos, constituyendo una nueva y poderosa herramienta.