DISEÑO DE UN BIOSENSOR NO INVASIVO PARA DETERMINAR NIVELES DE NADP+/NADPH IN VIVO MEDIANTE LAS PROPIEDADES FLUORESCENTES RATIOMÉTRICAS DE LA PROTEÍNA ROGFP2

MOLINARI, P.E; KRAPP, AR; BUSTOS-SANMAMED, P; ZURBRIGGEN, M.; CARRILLO, N.

Rosario

Congreso; XVIII Congreso y la XXXVI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2016

Sociedad de Biología de Rosario

DISEÑO DE UN BIOSENSOR NO INVASIVO PARA DETERMINAR NIVELES DE NADP+/NADPH IN VIVO MEDIANTE LAS PROPIEDADES FLUORESCENTES RATIOMÉTRICAS DE LA PROTEÍNA ROGFP2.Molinari, Pamela E.1, Krapp, Adriana R.1,2, Bustos-Sanmamed, Pilar2, Zurbriggen, Matías3 y Carrillo, Néstor1,2.1Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. Suipacha 531 (2000) Rosario, 2IBR-CONICET Argentina, Ocampo y Esmeralda (2000) Rosario, Argentina, 3Inst. Synthetic Biol. Heinrich Heine Univ. Dusseldorf Alemania. E mail: pmolinari@fbioyf.unr.edu.arLa detección de NADP+/NADPH en organismos vivos es un recurso analítico de mayor importancia para la biología. Sin embargo, los métodos disponibles son muy deficientes y no permiten distinguir los niveles presentes en distintos compartimentos celulares. Años atrás, la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria fue modificada introduciendo residuos superficiales de cisteína capaces de formar puentes disulfuros, creando la proteína roGFP2 (GFP sensible a reducción-oxidación). roGFP2 tiene dos máximos de excitación de fluorescencia a 400 y 490 nm y muestra cambios ratiométricos reversibles en la emisión de fluorescencia a 510 nm, in vitro e in vivo, en respuesta a los niveles de tioles del medio ambiente. El objetivo de este proyecto es diseñar un sensor no invasivo para determinar la relación NADP+/NADPH basado en las propiedades ratiométricas de roGFP2. Este biosensor consiste de una proteína específica para NADP(H), la tiorredoxina reductasa C dependiente de NADPH (NTRC), unida a roGFP2 a través de un brazo conector (BC). Se ensayaron distintas longitudes del BC a fin de determinar la geometría óptima de transferencia electrónica entre NTRC y roGFP2. Estas fusiones se expresaron en cepas de Escherichia coli que sobreexpresan chaperones moleculares para obtener máximos niveles de expresión y se purificaron en columna de Ni-NTA. El estado de oxidación del sensor NTRC-roGFP2 fue evaluado mediante medidas de fluorescencia y el potencial redox fue calculado con la ecuación de Nernst adaptada para la dupla NADP+/NADPH. Las relaciones de fluorescencia, reflejo del estado redox de NTRC-roGFP2, variaron con la concentración de NADPH indicando que NTRC-roGFP2 oxidada se equilibra con NADPH y funciona como sensor de este metabolito transduciendo los cambios redox de los piridín nucleótidos al universo de los tioles. El biosensor NTRC-roGFP2, es capaz de equilibrarse con NADP+/NADPH y en consecuencia el potencial redox de este par se determina de acuerdo al estado de oxidación del sensor. En carácter de prueba de concepto, NTRC-roGFP2 fue introducido en células de E. coli y su estado de oxidación se evaluó in vivo mediante microscopía confocal. Se observaron cambios en la fluorescencia de NTRC-roGFP2 en las células en respuesta a oxidantes y reductores, indicando que NTRC-roGFP2 podría funcionar como biosensor redox en células vivas. Este biosensor puede ser introducido en células animales y vegetales permitiendo detectar cambios en los niveles de NADP+/NADPH en el tiempo y en el espacio en tejidos vivos, constituyendo una nueva y poderosa herramienta para estudiar los procesos redox fundamentales de los seres vivientes.