Evaluación de la actividad enzimática de la enzima 3-HSD por cuantificación por LC-MS-MS (ESI-QQQ) de Progesterona y Pregnenolona

MARÍA PÍA HOLGADO; MICAELA AMIGO; MARÍA BELÉN VECCHIONE; MAGDALENA GHERARDI ; ANDREA C. BRUTTOMESSO

Congreso; XX Simposio Nacional de Química Orgánica, Sociedad Argentina de Investigación en Química Orgánica; 2015

XX Simposio Nacional de Química Orgánica, Sociedad Argentina de Investigación en Química Orgánica.

La enzima -hidroxiesteroide deshidrogenasa ( -HSD) está involucrada en lasíntesis de hormonas esteroidales con potente actividad anti-inflamatoria einmunosupresora. El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), posee un gen que codifica para una enzima con similitud a la 3Beta-HSD humana, generando de esta manera un estado anti-inflamatorio general que favorece la replicación viral. La eliminación de este gen, aumentaría la inmunogenicidad de MVA y convertiría a este vector es uno de los mejores candidatos a ser utilizado en el desarrollo de vacunas. En este trabajo nos proponemos evaluar la actividad enzimática de la 3 -HSD, cuantificando la producción de progesterona a partir de pregnenolona, en cultivos celulares sin infectar e infectados con el MVAwt y el MVAdelecionado, los cuales poseen o no la enzima.La cuantificación pregnenolona (PRE) y progesterona (PRO) se realizó utilizandola cromatografía líquida asociada a la espectrometría de masas con tecnología de triple cuadrupolo y equipada con electrospray como método de ionización (LC / ESI/ MSQQQ). Los patrones esteroidales se sintonizaron en soluciones milimolares de metanol, se prepararon diluciones seriadas para la optimización de los parámetros en el módulo de masas, obteniendo las transiciones (SRMs) en el modo ESI-positivo y se determinaron los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ).A partir de las sintonizaciones previas de los compuestos esteroidales se realizó, la curva de calibración y se procedió a la determinación de dichos compuestos en muestras en extractos de cultivos celulares con pregnenolona, con y sin infección del virus MVAwt y con el MVAdelecionado encontrando una concentración basal de progesterona en cultivos celulares sin infectar y en cultivos infectados con MVA delecionado.