Role of androgen receptor in the protective action of testosterone during apoptosis in skeletal muscle.

PRONSATO, LUCÍA; MILANESI, LORENA; BOLAND, RICARDO

Buenos Aires

Simposio; Frontiers in BioScience; 2012

Joint Symposium of the Max Planck Society and the Ministry of Science, Technology and the Ministry of Science, Technology and Innovation.

“ROL DEL RECEPTOR DE TESTOSTERONA FRENTE A LA APOPTOSIS EN CÉULAS MUSCULARES ESQUELÉICAS MURINAS” La pérdida de masa y fuerza del músculo esquelético, característico de ciertas miopatías como la sarcopenia, es una condición frecuente durante el envejecimiento, y está asociada a disfunciones de los sistemas muscular y esquelético. Aunque los mecanismos moleculares involucrados en esta patología aun no han sido dilucidados, existen evidencias que demuestran que la apoptosis es, en parte, responsable de la pérdida de miocitos en la adultez, contribuyendo a la reducción de la masa muscular y a la patogénesis de la sarcopenia. Puesto que los niveles de hormonas sexuales disminuyen con la edad, la sarcopenia se ha asociado al déficit de las mismas. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que la testosterona protege frente a la apoptosis inducida por la exposición al H2O2 durante tiempos prolongados, en la línea celular de músculo esquelético murino C2C12. Las alteraciones morfológicas típicas de la apoptosis tales como la fragmentación nuclear, desorganización del citoesqueleto, reorganización/disfunción mitocondrial y liberación de citocromo c inducidos por el H2O2, son inhibidas cuando las células se exponen previamente a la hormona. También, comenzamos a identificar los eventos moleculares que tienen lugar en el efecto antiapoptótico de la testosterona sobre las células C2C12 las cuales exhiben una respuesta bifásica cuando son tratadas con el agente apoptótico. A tiempos cortos de exposición al H2O2, las células activan un mecanismo de defensa para evitar entrar en apoptosis, el cual consiste en la fosforilación de ERK2, Akt y Bad y en un aumento de expresión de la proteína asociada a eventos de supervivencia, HSP70. A tiempos largos de tratamiento con el agente apoptótico, se observa defosforilación de las proteínas antes mencionadas, liberación de citocromo c, clivaje de PARP, fragmentación del DNA y pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicando que las células inician finalmente el proceso de muerte celular programada. Sin embargo, cuando las células son tratadas con testosterona, previo a la exposición al H2O2, observamos inactivación de la proteína apoptótica Bad, disminución de los niveles de la proteína apoptótica Bax, inhibición del clivaje de PARP e incremento en el potencial de membrana mitocondrial y en los niveles de actina. Por lo que a tiempos largos en presencia del agente apoptótico, las células entran finalmente en apoptosis, y es en este momento cuando la testosterona ejerce su efecto protectivo. El agregado de flutamida (antagonista no esteroideo específico de la testosterona que actúa inhibiendo la unión de ésta al receptor de andrógenos, AR) previo al tratamiento con la hormona y el H2O2, bloquea casi totalmente la acción protectiva del esteroide. Esto sugiere la participación del AR en el efecto antiapoptótico de la testosterona en las células C2C12. A su vez, hemos demostrado la localización no clásica del AR en microdominios (específicamente caveolas y rafts) y mitocondrias, mediante ensayos de competición empleando el esteroide tritiado, análisis de Western blots a fracciones subcelulares y gradientes de sacarosa, y estudios de inmunocitoquímica y microscopía convencional de fluorescencia con células enteras utilizando anticuerpos específicos contra el AR. Estos resultados indican un rol activo del AR en la mediación del efecto antiapoptótico de la testosterona a distintos niveles según su localización subcelular: núcleo (mediador de la respuesta genómica); mitocondria (mediador de la vía intrínseca), microsomas (mediador de las respuestas asociadas a proteínas de membrana). Si bien estudios adicionales son claramente necesarios para elucidar completamente los mecanismos de señalización activados por la testosterona y el AR y su relación con miopatías asociadas al déficit de hormonas sexuales, los datos obtenidos permiten asignarle una función protectiva a la testosterona a través de su receptor específico, frente al daño oxidativo en músculo esquelético. evitar entrar en apoptosis, el cual consiste en la fosforilación de ERK2, Akt y Bad y en un aumento de expresión de la proteína asociada a eventos de supervivencia, HSP70. A tiempos largos de tratamiento con el agente apoptótico, se observa defosforilación de las proteínas antes mencionadas, liberación de citocromo c, clivaje de PARP, fragmentación del DNA y pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicando que las células inician finalmente el proceso de muerte celular programada. Sin embargo, cuando las células son tratadas con testosterona, previo a la exposición al H2O2, observamos inactivación de la proteína apoptótica Bad, disminución de los niveles de la proteína apoptótica Bax, inhibición del clivaje de PARP e incremento en el potencial de membrana mitocondrial y en los niveles de actina. Por lo que a tiempos largos en presencia del agente apoptótico, las células entran finalmente en apoptosis, y es en este momento cuando la testosterona ejerce su efecto protectivo. El agregado de flutamida (antagonista no esteroideo específico de la testosterona que actúa inhibiendo la unión de ésta al receptor de andrógenos, AR) previo al tratamiento con la hormona y el H2O2, bloquea casi totalmente la acción protectiva del esteroide. Esto sugiere la participación del AR en el efecto antiapoptótico de la testosterona en las células C2C12. A su vez, hemos demostrado la localización no clásica del AR en microdominios (específicamente caveolas y rafts) y mitocondrias, mediante ensayos de competición empleando el esteroide tritiado, análisis de Western blots a fracciones subcelulares y gradientes de sacarosa, y estudios de inmunocitoquímica y microscopía convencional de fluorescencia con células enteras utilizando anticuerpos específicos contra el AR. Estos resultados indican un rol activo del AR en la mediación del efecto antiapoptótico de la testosterona a distintos niveles según su localización subcelular: núcleo (mediador de la respuesta genómica); mitocondria (mediador de la vía intrínseca), microsomas (mediador de las respuestas asociadas a proteínas de membrana). Si bien estudios adicionales son claramente necesarios para elucidar completamente los mecanismos de señalización activados por la testosterona y el AR y su relación con miopatías asociadas al déficit de hormonas sexuales, los datos obtenidos permiten asignarle una función protectiva a la testosterona a través de su receptor específico, frente al daño oxidativo en músculo esquelético. evitar entrar en apoptosis, el cual consiste en la fosforilación de ERK2, Akt y Bad y en un aumento de expresión de la proteína asociada a eventos de supervivencia, HSP70. A tiempos largos de tratamiento con el agente apoptótico, se observa defosforilación de las proteínas antes mencionadas, liberación de citocromo c, clivaje de PARP, fragmentación del DNA y pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicando que las células inician finalmente el proceso de muerte celular programada. Sin embargo, cuando las células son tratadas con testosterona, previo a la exposición al H2O2, observamos inactivación de la proteína apoptótica Bad, disminución de los niveles de la proteína apoptótica Bax, inhibición del clivaje de PARP e incremento en el potencial de membrana mitocondrial y en los niveles de actina. Por lo que a tiempos largos en presencia del agente apoptótico, las células entran finalmente en apoptosis, y es en este momento cuando la testosterona ejerce su efecto protectivo. El agregado de flutamida (antagonista no esteroideo específico de la testosterona que actúa inhibiendo la unión de ésta al receptor de andrógenos, AR) previo al tratamiento con la hormona y el H2O2, bloquea casi totalmente la acción protectiva del esteroide. Esto sugiere la participación del AR en el efecto antiapoptótico de la testosterona en las células C2C12. A su vez, hemos demostrado la localización no clásica del AR en microdominios (específicamente caveolas y rafts) y mitocondrias, mediante ensayos de competición empleando el esteroide tritiado, análisis de Western blots a fracciones subcelulares y gradientes de sacarosa, y estudios de inmunocitoquímica y microscopía convencional de fluorescencia con células enteras utilizando anticuerpos específicos contra el AR. Estos resultados indican un rol activo del AR en la mediación del efecto antiapoptótico de la testosterona a distintos niveles según su localización subcelular: núcleo (mediador de la respuesta genómica); mitocondria (mediador de la vía intrínseca), microsomas (mediador de las respuestas asociadas a proteínas de membrana). Si bien estudios adicionales son claramente necesarios para elucidar completamente los mecanismos de señalización activados por la testosterona y el AR y su relación con miopatías asociadas al déficit de hormonas sexuales, los datos obtenidos permiten asignarle una función protectiva a la testosterona a través de su receptor específico, frente al daño oxidativo en músculo esquelético.