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Desarrollo de complejos enzimáticos celulolíticos y xilanolíticos microbianos para la valorización de recursos agroindustrialesMercedes M Garrido1, 2, Sonia A Wirth1, Eleonora Campos21Laboratorio de Agrobiotecnología, DFBMC, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, IBBEA-CONICET-UBA, Piso 2, Pabellón 2, Ciudad Universitaria, C1428EG, Buenos Aires, Argentina. 2Laboratorio de Bioenergía, Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Los Reseros y Nicolás Repetto s/n (1686), Buenos Aires, Argentina.Contacto: mercedes.garrido.mg@gmail.comResumenLa degradación de la celulosa genera azucares simples que pueden ser fermentados a etanol y de ahí su importancia para la obtención de biocombustibles. El presente trabajo se centra en el paso crítico para la utilización de biomasa que es la complejidad de degradar la pared de lignocelulosa. El objetivo es el desarrollo de complejos enzimáticos de celulasas, hemicelulasas y enzimas accesorias recombinantes fúngicas para la sacarificación de la celulosa y degradación de hemicelulosa, con el fin de estudiar su utilización en el aprovechamiento de los residuos agroforestoindustriales. Para ello se comenzó con la identificación de las secuencias codificantes para enzimas activas sobre carbohidratos del hongo basidiomicete de la pudrición blanca Pycnoporus sanguineus. En particular, se amplificaron y clonaron las secuencias codificantes para una monooxigenasa de polisacáridos (AA9, ex GH61), una β-xilosidasa (GH3) y una endo-arabinosidasa (GH43), a partir del cDNA total del hongo. Éstas presentaron identidad de secuencia de hasta 85 %, 88 % y 80 %, respectivamente, con enzimas fúngicas de las familias mencionadas. La identidad e integridad de los productos de amplificación fueron confirmadas por secuenciación.Palabras clave: Pycnoporus sanguineus, enzimas, AA9, GH3, GH431. IntroducciónLa utilización de materias primas de naturaleza lignocelulósica está siendo intensamente investigada en todo el mundo debido a que es un recurso sustentable y de bajo costo. Sin embargo, la complejidad química y estructural de la biomasa vegetal y la falta de complejos enzimáticos optimizados y de bajo costo que permitan su degradación completa, han dificultado los avances en su utilización. Para la deconstrucción eficiente de la biomasa lignocelulósica es necesario el desarrollo de cócteles enzimáticos o consorcios microbianos optimizados, o suplementar los actualmente disponibles con una mayor variedad de actividades enzimáticas, que permitan sobrepasar la inhibición de la reacción por acumulación de sustrato insoluble y de intermediarios tóxicos. Los hongos xilófagos han desarrollado una gran diversidad de actividades enzimáticas que les permiten degradar la compleja matriz de lignocelulosa para acceder a las unidades de azúcares fermentables. Partiendo de la hipótesis que glicosilhidrolasas del hongo Pycnoporus sanguineus pueden actuar sinérgicamente con preparaciones comerciales de celulasas para la deconstrucción de biomasa lignocelulósica, el objetivo del trabajo se centra en la obtención y caracterización de nuevas enzimas que permitan la sacarificación eficiente de la celulosa. Se cree que los resultados obtenidos permitirán la optimización del uso de residuos agroforestoindustriales en la producción de bioetanol y en procesos de biorefinerías.2. MetodologíaUtilizando la información del transcriptoma de un aislamiento nativo del hongo de la pudrición blanca Pycnoporus sanguineus (BAFC 2126) realizado en el laboratorio de Agrobiotecnología, DFBMC, FCEN-UBA [Rhor y col. 2013] y el genoma de la cepa BRFM 1264 (http://genome.jgi.doe.gov/Pycsa1/Pycsa1.home.html) se seleccionaron las secuencias codificantes de una monooxigenasa de polisacáridos de la familia AA9, una endo-arabinosidasa de la familia GH43 y una β-xilosidasa de la familiaGH3 y se diseñaron oligonucleótidos específicos para su amplificación por PCR a partir del cDNA sintetizado del RNA total del hongo crecido en condiciones de inducción de la expresión de estos genes (condiciones utilizadas para la obtención del transcriptoma). La predicción in sílico de secuencias señal se hizo utilizando el programa signalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/).Los genes de P. sanguineus se expresarán en sistemas eucariotas (Pichia pastoris), en el vector pPIC9K (Invitrogen Life Technologies). En el caso de la monooxigenasa AA9 se expresará la secuencia nativa fusionada a un tracto de 6xHIS C-terminal. Para las GH3 y GH43 se harán fusiones N-terminales del tag de histidinas y se reemplaza la secuencia señal nativa por la del factor α de S. cerevisiae presente en pPIC9K. La purificación de las proteínas secretadas se hará por cromatografía de afinidad utilizando resinas de Ni-NTA (Sigma Aldrich). Para la caracterización bioquímica (actividad, perfiles de pH, temperatura, parámetros cinéticos, etc.) se utilizarán ensayos de actividad sobre sustratos específicos y se determinarán por HPLC los productos de hidrólisis de su actividad sobre biomasa lignocelulósica pre-tratada, solas o en combinación con preparados de celulasas comerciales.3. Resultados y DiscusiónUtilizando los oligonucleótidos diseñados a partir del análisis bioinformático se amplificaron por PCR fragmentos del tamaño esperado para las secuencias codificantes de la monooxigenasa de polisacáridos AA9 (1040bp), la ß-xylosidasa GH3 (2270 bp) y la endo-arabinosidasa GH43 (950bp) a partir de cDNA sintetizado del RNA total extraído del hongo. Las secuencias amplificadas se purificaron y subclonaron en el vector comercial pGEMTeasy (Promega) para su secuenciación (Macrogen Inc). El análisis in silico de las secuencias obtenidas permitió confirmar el clonado de una monooxigenasa de polisacáridos con homologías del 85 % con otras enzimas de la familia AA9. Se encontraron presentes residuos aminoacídicos que fueron reportados como altamente conservados en otras AA9s (His1, His83 y Tyr164), que están involucrados en la unión a metales [Kim et al., 2015]. Asimismo el análisis de la secuencia codificante de la ß-xilosidasa mostró identidades del 88 % con otras ß-xylosidasas fúngicas de la familia GH3, presentando el dominio conservado de dicha familia. Al compararla con la secuencia reportada del hongo Aspergillus japonicus [Wakiyama et al., 2008], se identificaron los residuos catalíticos putativos Asp265 y Glu468. Por último se confirmó el clonado de una endo-arabinosidasa con homologías del 80 % con otras endo-arabinosidasas fúngicas de la familia GH43. Al estudiar la secuencia obtenida se identificaron los residuos involucrados en el sitio catalítico, siendo Asp132 y Glu183 los más importantes [Shi et al., 2014].4. ConclusionesLos biocombustibles generados a partir de biomasa lignocelulósica resultan una opción favorable para el consumo de combustible debido a su renovabilidad, biodegradabilidad y por la calidad de gases que emiten. En el presente trabajo se lograron aislar y clonar secuencias codificantes de enzimas de Pycnoporus sanguineus que podrían mejorar la eficiencia de sacarificación de la biomasa lignocelulósica. Es importante continuar trabajando en la búsqueda de enzimas para desarrollar nuevos cócteles enzimáticos optimizados o suplementar los actualmente disponibles.BibliografíaKim I., Nam K., Yun E., Kim S., Youn H., Lee H., Choi I., Kim K. (2015). Optimization of synergism of a recombinant auxiliary activity 9 from Chaetomiumglobosum with cellulase in cellulose hydrolysis. Applied Microbiology Biotechnology, 99: 8537-8547.Rohr CO, Levin LN, Mentaberry AN, Wirth SA. (2013). A first insight into Pycnoporus sanguineus BAFC 2126 transcriptome. PLoS One. Dec 2; 8(12): e81033.Shi H., Ding H., Huang Y., Wang L., Zhang Y., Li X., Wang F. (2014). Expression and characterization of a GH43 endo-arabinase from Thermotoga thermarum. BMC Biothecnology 14: 35.Wakiyama M., -yoshihara K., Hayashi S. & Ohta K. (2008). Purification and properties of an extracellulas B-xylosidase from Aspergillus japonicas and sequence analysis of the encoding gene. Journal of Bioscience and Bioengineering, 106(4): 398?404.