Generación de bacterias modificadas genéticamente para la eliminación de hidrocarburos tóxicos. Biodegradación de 2,4-dinitrotolueno

MONTI MARIELA. R.; SMANIA ANDREA M.; ARGARAÑA CARLOS E.

Córdoba-Argentina

Workshop; Segundo Workshop Ítalo-Argentino para la química sustentable; 2003

El proceso de industrialización ha resultado en la introducción dentro de la biosfera de grandes cantidades de sustancias orgánicas sintéticas (xenobióticos). Muchas de ellas presentan un alto grado de toxicidad, por lo que su acumulación en la naturaleza constituye un problema ambiental prioritario. El aislamiento de bacterias capaces de metabolizar un importante espectro de sustancias xenobióticas, posibilitó la implementación de  procesos biotecnológicos para la eliminación de estos compuestos presentes en ambientes contaminados y en residuos industriales. Sin embargo, no siempre la bacteria aislada es óptima para llevar a cabo un determinado proceso biodegradativo. Surge así como alternativa, la implementación de metodologías de biología molecular para modificar genéticamente estos microoganismos con la finalidad de adaptarlos a los requerimientos del bioproceso. Dentro de los contaminantes considerados prioritarios, se encuentra el 2,4-dinitrotolueno (DNT) utilizado como intermediario en la síntesis de toluendiisocianato (TDI) para la fabricación de espuma de poliuretano. Si bien el DNT puede ser eliminado por incineración, un proceso biodegradativo constituye una alternativa más económica y ambientalmente ventajosa. En los últimos años, ha sido descripta una vía oxidativa para la mineralización de DNT por una cepa de Burkholderia cepacea la cual involucra la acción consecutiva de al menos cinco enzimas específicas codificadas en un megaplásmido. Aunque B. cepacea puede mineralizar eficientemente el DNT, esta cepa posee el inconveniente de perder dicha capacidad cuando se desarrolla en medios sin DNT. Además esta especie ha sido caracterizada como fitopatógena y patógena oportunista en humanos. Así, el principal objetivo de nuestra investigación es la construcción de una bacteria recombinante mediante la transferencia de los genes que codifican para las enzimas degradativas del DNT de B. cepacea (genes dnt) a una bacteria inocua tal como Pseudomonas fluorescens. En una primera etapa, los genes dntA, dntB y dntD previamente clonados en vectores adecuados, fueron transferidos al cromosoma de P. fluorescens mediante eventos de conjugación y transposición utilizando plásmidos de la serie pUT-miniTn5. Posteriormente, los genes dntG y dntE, fueron clonados y transferidos en un plásmido de amplio rango de huésped. La inserción y funcionalidad de los genes fue confirmada por Southern Blot y por ensayo in vivo de las actividades enzimáticas respectivamente. Con esta bacteria genéticamente modificada, se realizaron análisis de biodegradación por HPLC a partir de cultivos incubados con DNT como única fuente de carbono observando que la misma, a pesar de no manifestar un crecimiento evidente, degrada el DNT sin la acumulación de intermediarios y la concomitante liberación de NO2. Actualmente y con el objeto de generar un fenotipo estable continuamos trabajando en la inserción del los genes dntG y dntE en el cromosoma de la P. fluorescens recombinante y en el análisis de las condiciones óptimas para su crecimiento en medios con DNT como única fuente de carbono y energía.