“Producción de Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) en cultivos de hepatocitos aislados de ratas sham y hepatectomizadas.”

FRANCÉS D; ALVAREZ L; QUIROGA A; PARODY JP; OCHOA E,; CARRILLO C; RONCO T; CARNOVALE C

Rosario, Argentina

Congreso; VI Congreso XXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2004

Sociedad de Biología Rosario

En trabajos “in vivo”, demostramos que a 1, 5 y 24 horas post-hepatectomía existe en el hígado remanente un aumento de especies reactivas del oxígeno estimadas por el nivel de lipoperoxidación. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar la producción de ROS en cultivos de hepatocitos aislados de ratas sham y hepatectomizadas. Ratas Wistar machos adultas fueron sometidas a hepatectomía parcial del 65% (HP) o a cirugía simulada (Sham, Sh) (n=5 de cada grupo). Una hora post-cirugía se obtuvieron hepatocitos aislados por el método de perfusión con colagenasa. De esa población enriquecida se determinaron concentración y viabilidad mediante la exclusión de Azul de Tripán. De ambos grupos estudiados se cultivaron aquellas suspensiones cuya viabilidad resultó ser mayor del 85%. No se obtuvo diferencias entre las viabilidades de los grupos Sh y HP. Los hepatocitos fueron sembrados en placas de Petri (1,5.106 cél/placa) con medio de cultivo completo (RPMI 1640). Después de 2 horas de incubación el medio fue removido y reemplazado por medio de cultivo fresco. La formación de ROS fue determinado a la hora, 3 y 24 horas de cultivo. El método se basa en la incubación de células con el compuesto no fluorescente DCFH-DA (2´,7´-diacetato de diclorofluoresceína), el cual difunde pasivamente a través de las membranas celulares. Las esterasas intracelulares transforman la DCFH-DA en el compuesto no fluorescente DCFH, el cual es oxidado por las sustancias reactivas del oxígeno (ROS) al compuesto fluorescente DCF. A los tiempos mencionados se incubaron los cultivos con DCFH-DA (5mM) por 20 minutos a 37 ºC con 5% de CO2. Las células fueron lavadas y levantadas con Ringer para realizar las lecturas de fluorescencia usando una lexi=488nm y lemi=525nm. Los valores obtenidos fueron: Sh(1h)=555,92±99,97; HP(1h)=601,69±65,01;  Sh(3hs)= 532,34±19,82; Sh(24hs)=292,91±49,88#; HP(3hs)= 567,25±45,58; HP(24hs)=566,54±85,46* *p<0,05 vs. Sh(24hs); #p<0,05 vs. Sh(3hs). A la hora y a 3 hs. de cultivo no existen diferencias entre los hepatocitos Sh y HP lo cual podría deberse al estrés producido por la técnica de obtención. A las 24 hs. de cultivo se observa un aumento sostenido del contenido de ROS en HP, sugiriendo que a este tiempo de cultivo los hepatocitos expresan una diferenciación debida a la HP parcial. En conclusión, para realizar estudios del proceso de regeneración en hepatocitos aislados sería conveniente utilizar cultivos de 24 horas.