Infección estable de la línea celular epitelial mamaria bovina (MAC-T) con el virus de la leucosis bovina (BLV)

MARTINEZ CUESTA L; NIETO FARIAS, MV; LENDEZ, P; PORPORATTO, C; BOHL, LP; DOLCINI, G; CERIANI, C

Buenos Aires

Congreso; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología (SAV); 2016

INTRODUCCION: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus ampliamente distribuido en los tambos de nuestro país. La transmisión ocurre por transferencia de linfocitos B infectados, generalmente como resultado de procedimientos iatrogénicos. El BLV puede transmitirse además en forma vertical a través de calostro. Se ha descripto la presencia de ADN proviral y de la proteína de 24kDa de la cápside del virus en linfocitos infectados y células epiteliales mamarias bovinas. La infección viral se ha asociado a una disminución en la producción de leche y a un aumento en la susceptibilidad a otras infecciones como la mastitis, de ahí la importancia de evaluar el efecto del virus sobre células de la glándula mamaria bovina. El objetivo de este trabajo fue lograr una infección estable de la línea celular epitelial mamaria bovina MAC-T con BLV. MATERIALES Y METODOS: Se obtuvieron 60 ml de sangre entera anticoagulada con citrato de sodio de un bovino infectado con BLV que presenta alta carga proviral. Se aislaron los linfocitos de sangre periférica (PBMC) mediante el método de Ficoll-Histopaque. La línea celular MAC-T se mantuvo en DMEM con 5 % de suero fetal bovino en atmosfera de CO2 al 5%. Los PBMC se co-cultivaron con las MAC-T por 24 hs, luego de lo cual se retiró el medio de cultivo y se realizaron lavados con PBS y un lavado con tripsina. Luego de 10 pasajes se extrajo ADN de las células (en adelante MAC-T/BLV) utilizando un kit comercial (Qiagen). El ADN obtenido se utilizó como templado en una nested-PCR que amplifica específicamente un fragmento del gen env del BVL. Como control positivo se utilizó ADN de FLK, una línea celular persistentemente infectada con BLV. Como control negativo se utilizó ADN obtenido de la línea celular MAC-T original. Se realizó un Western blot para detectar la proteína viral p24 en el sobrenadante de cultivo de MAC-T, MAC-T/BLV y FLK como control positivo. RESULTADOS: Como resultado de la nested-PCR se observó una banda específica en las MACT-BLV y en el control positivo, compatible con el fragmento esperado del gen env, de 444 pb. En el Western blot se observó una banda de aproximadamente 24 kDa en el sobrenadante de MAC-T/BLV y FLK, compatible con la proteína viral p24. CONCLUSIONES: Es posible infectar con BLV células epiteliales mamarias bovinas in vitro. La infección se mantiene estable en el tiempo. La expresión de p24 en el sobrenadante del cultivo es un indicador de la expresión viral in vitro. PERSPECTIVAS: Esta nueva línea celular podrá ser de utilidad como modelo in vitro para estudiar los efectos del BLV en la glándula mamaria. Permitirá evaluar el efecto del virus sobre la sobrevida celular e inducción de muerte por apoptosis en las células MAC-T/BLV, así como cambios en la expresión de citoquinas y sus receptores, cuyo desbalance se ha asociado con la progresión de la infección viral.