ESTUDIO DE LA ADHERENCIA DE DIFERENTES AISLAMIENTOS DE T. foetus SOBRE ESPERMATOZOIDES BOVINOS CRIOPRESERVADOS

MONTEAVARO C.; CACCIATTO C.; CHRISTENSEN, S.; ROCHA AGUILAR CHRISTIAN; DOUMECQ , M.L.; SOTO, P.

Villa Giardino, Córdoba

Jornada; XXXIV Jornadas de Actualización en Ciencias Veterinarias; 2015

Colegio de Medicos Veterinarios de la provincia de Córdoba

INTRODUCCIÓN La Tricomonosis bovina venérea, es causada por Tritrichomonas foetus, parásito extracelular que sobrevive en semen criopreservado (bovino). Uno de los mecanismos de patogenicidad es la adherencia y posterior efecto citotóxico (Campero y Cobo 2006). Existen reportes de los efectos de la interacción entre T. foetus y líneas celulares, cultivos primarios de células epiteliales de vagina (Singh et al 2005) y más recientemente con espermatozoides bovinos, observándose adhesión, fagocitosis y alteración de la motilidad (Benchimol et al 2008). En un estudio de caracterización patogénica de aislamientos de T. foetus hemos encontrado diferentes porcentajes de persistencia en la infección intravaginal (Doumecq et al 2008), y variaciones en la expresión de carbohidratos (Doumecq et al 2014). El objetivo del presente trabajo es analizar la interacción entre los diferentes aislamientos de T. foetus y espermatozoides bovinos provenientes de semen criopreservado. MATERIALES Y MÉTODOSTritrichomonas foetus: los aislamientos provienen de muestras de esmegma prepucial bovino; criopreservados en nitrógeno líquido y conforman el cepario del Laboratorio de Microbiología Clínica y Experimental de la FCV-UNCPBA. Cada aislamiento fue descongelado y sembrado en medio TYM (Triptose-yeast-maltose) e incubado a 37°C durante 48 h. Luego se lavó con PBSS (0,01 M buffer fosfato de sodio, 8,5 g/L ClNa) pH 7,2 mediante centrifugación a 3000 rpm. Se llevó a una concentración de 106Tf/mL en un medio para cultivos celulares (Dulbecco?s Modificado Eagle Medium, D-MEM, Gibco) suplementado con 2% de suero fetal bovino. Espermatozoides bovinos criopreservados: Se utilizaron pajuelas de inseminación de una partida de un mismo toro, mantenidas en nitrógeno líquido hasta su utilización. Se realizó el descongelado en un baño termostatizado a 37°C durante 30 minutos. El volumen de la pajuela se suspendió en 0,5 mL de solución fisiológica estéril y se observó la motilidad utilizando una platina térmica a 37 °C la cual fue entre un 70 a 80%. La viabilidad se determinó mediante coloración vital con eosina-nigrosina. Se realizó una dilución 1/100 en solución alcohólica al 1 % para el conteo en cámara de Neubauer. Se preparó y se ajustó el volumen de trabajo a una concentración de 106 /mL en medio D-MEM sin antibiótico suplementado con 2% de suero fetal bovino y se mantuvo en baño termostatizado a 37°C. Ensayo de coincubación de T. foetus y espermatozoides: Se realizó en placas de 24 pocillos (COSTAR®). Se partió de protozoarios y espermatozoides conteniendo la misma concentración de 106 /ml. La relación final fue de 1:2 (protozoario/espermatozoide). El volumen correspondiente a cada aislamiento de T. foetus fue de 125 µl por pocillo, con el agregado de 125 µl de medio de cultivo y 250 µl de espermatozoides. Las placas fueron incubadas en una estufa con 5% de CO2 a 37°C. Las lecturas se realizaron sobre una platina térmica a 37°C en un microscopio invertido (Olympus CK2, Japan), utilizándose los objetivos de 10X y 20X. Las lecturas se hicieron a los 30, 90 y 180 minutos.Luego de la incubación se retiraron 20 µl del pocillo y se realizó el extendido en un portaobjeto para realizar la coloración vital con eosina-nigrosina.Para observar la morfología de las células y la interacción entre ambas, se tomaron 10 µl y se realizó el extendido sobre una superficie de 1 cm2 marcada en un portaobjeto. Se dejó secar al aire, se fijó con metanol y finalmente se realizó la coloración T15.Para determinar el porcentaje de adherencia se consideró los protozoarios adheridos con respecto al total de protozoarios. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:Con respecto al tiempo de coincubación se determinó los 90 minutos como el más adecuado. A los 30 minutos se observó baja interacción y a los 180 minutos los espermatozoides se encontraron aglutinados y la morfología de los protozoarios alterada.En la observación directa con microscopio invertido, los protozoarios y los espermatozoides se encontraron viables durante el tiempo de lectura. La adherencia en la mayoría de los aislamientos se observó a través de la interacción entre el soma, axostilo o blefaroplasto del protozoario y la cabeza, cuerpo medio y cola del espermatozoide. El número de protozoarios adheridos por espermatozoide fue variable desde 1 a 4. El porcentaje de adherencia también fue variable entre los aislamientos, en un rango desde 7,7 al 37,9 %. La viabilidad observada estuvo entre un 0 a 28,84% para los espermatozoides y de un 61,54 a 100% para los protozoarios dependiendo del aislamiento. El control de viabilidad de los espermatozoides en las condiciones del ensayo y tiempo de lectura fue del 30,6%.Cuando analizamos el porcentaje de adherencia y espermatozoides viables, el 61,54 % de los aislamientos demostró que un alto porcentaje de adherencia se relaciona con un bajo porcentaje de viabilidad de espermatozoides. Esto podría estar relacionado con los mecanismos de patogenicidad descriptos por Benchimol et al., (2008).