Proliferación y cuantificación de los LTCD8 por citometría de flujo en bovinos que reaccionan a la prueba de tuberculina y transitan el periparto temprano

TRAVERSA J; PAOLICCHI F.A.; ESTEIN S. M.; RODRIGUEZ E.M.; JORGE M.C.

La Plata

Congreso; III Congreso Panamericano - VIII Congreso Argentino de Zoonosis.; 2014

AAZ

INTRODUCCIÓN: La tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa granulomatosa crónica causada por Mycobacterium bovis que afecta a los bovinos, a otras especies animales y al hombre. En los bovinos con infección establecida experimentalmente por la vía aerógena se ha registrado que la respuesta inmune celular es más precoz que la humoral, y además es esencial para proteger al hospedador contra la infección. Si bien la respuesta celular es la más precoz y predominante en las etapas iniciales de la enfermedad tiende a debilitarse conforme la misma progresa. En el ganado infectado con M. bovis se ha determinado la dinámica de las subpoblaciones de los linfocitos T (LT) con respuesta antigénica específica encontrando que la misma comprende tres fases. En la primera fase se describe un descenso seguido de un aumento en la cantidad de los LTγδ, en la segunda fase se involucran los LTαβ donde se observa un aumento de los LTCD4 circulantes que son esenciales en la respuesta inmune contra las micobacterias y durante la tercera se presenta una mayor actividad de los LTCD8. La inmunosupresión durante la gestación en los bovinos es un evento descrito en la fisiología de la inmunidad dado que en este período se presentan el intercambio de inmunidad entre la madre y el feto y la tolerancia materna al feto. Esta situación está causada por alteraciones estructurales del tejido linfoide entre otros mecanismos; dentro de las mismas se conoce que los LT disminuyen 3 semanas preparto retornando a sus valores normales a las 16 semanas postparto y que los LTCD8 se normalizan más precozmente que los LTCD4. Es por esto que el objetivo del presente estudio fue determinar y cuantificar la capacidad proliferativa de las subpoblaciones linfocitarias de LTCD8 en bovinos reaccionantes a la prueba de tuberculina que transitan el periparto temprano mediante la técnica de citometría de flujo. MATERIALES Y MÉTODOS: De 19 hembras bovinas Holando Argentino (HA) mayores de dos años se tomaron 15 mL de sangre entera a partir de los cuales se obtuvieron leucocitos mononucleares periféricos (LMP) mediante centrifugación en gradiente de Histopaque1077. Los grupos experimentales fueron conformados por 10 hembras bovinas tuberculinopositivas 5 que transitaban el periparto temprano (PPDPP), determinado entre tres semanas antes del parto y tres semanas posteriores al mismo, y 5 que no (PPD) y por 9 hembras bovinas tuberculinonegativas de las cuales 5 transitaban el periparto temprano (PP) y cuatro no (NoPPDNoPP). Por cada animal se estimularon 500 000 LMP con 500 μL de RPMI suplementado que contenía 20 μg/mL de derivado proteico purificado bovino y se incubaron a 37°C en atmósfera de CO2 durante seis días, además se sembraron los controles respectivos y se apartaron 500 000 LMP para realizar la determinación correspondiente al tiempo cero. Para estudiar los LMP mediante citometría de flujo los mismos se inmunomarcaron con un protocolo de marcación indirecto aplicando en la inmunomarcación primaria 50 μL del anticuerpo monoclonal (MAb) IgM BAQ111A (VMRD INC, Pullman, EEUU) y un anticuerpo secundario antiIgM ligado al fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson Immuno Research Laboratories INC, Bar Harbor, EEUU) dilución 1:200. Durante las inmunomarcaciones primaria y secundaria se realizaron sucesivos lavados para eluir ambos anticuerpos. Finalizado el proceso de inmunomarcación los LMP se fijaron y almacenaron en oscuridad hasta su adquisición con un citómetro de flujo BD FACSCanto? (BD?, Franklin Lakes, EEUU). El análisis de la información adquirida se realizó con el programa FCS Express 3 (De Novo Software, Los Angeles, EEUU) versión libre obteniéndose así los porcentajes iniciales y finales de los LTD8. Primeramente se realizó un gráfico de puntos donde en el eje de las ordenadas se graficó el ángulo de la luz side scatter (SSC), en el de las abscisas el forward scatter (FSC) y finalmente se definió el gate para los LMP. En un segundo gráfico de puntos se definió las subpoblación de LTCD8 sobre la base de la fluorescencia en el canal para FITC y se aplicó el gate definido en el primer gráfico. Para corroborar los gates de positividad se realizaron histogramas para el canal de fluorescencia en FITC donde se determinó este pico de fluorescencia el que fue backgated al segundo gráfico. Los niveles de LTCD8 en los cuatro grupos experimentales, fueron comparados mediante un análisis de variancia utilizando el software estadístico InfoStat. RESULTADOS: En el grupo PPD los valores medios iniciales de LTCD8 fueron de 12,92% y los medios finales de 16,79% y en el grupo NoPPDNoPP estos valores fueron de 20,41% y 21,35% respectivamente. En el grupo PPDPP los valores medios iniciales y finales fueron de 28,46% y 22,65% y en el grupo PP de 16,60% y 13,21%. Cuando se realizó el análisis estadístico se observó que las diferencias significativas (p=0,0001) en el valor final de LTCD8 estaban explicadas por el valor medio inicial de los LTCD8 significativamente superior en el grupo experimental PPDPP. DISCUSIÓN: En los bovinos PPDPP se encontró que los LTCD8 iniciales presentaban un valor significativamente mayor al reportado para un bovino normal lo cual favorece un perfil celular de tipo citotóxico en lugar de uno colaborador de tipo 1 que es el perfil inmunitario que protege contra le enfermedad. BIBLIOGRAFÍA Pastoret, P.P.; Griebel, P.; Bazin, H.; Govaerts, A. (1998). Immunology of Cattle, pp 439-484. En: Hanbook of vertebrate immunology. Academic Press Editores. Londres, Gran Bretaña Pollock, J.M.; Neill S.D. (2002). Mycobacterium bovis infection and tuberculosis in cattle. The Veterinary Journal. 163, 115-127 Van Kampen, C.; Mallard, B.A. (1997). Effects of peripartum stress and health on circulating bovine lymphocyte subsets. Veterinary Immunology and Immunopathology. 59(1-2),79-91