Producción de una proteína de fusión entre los antígenos de secreción temprana de Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 y CFP-10: Caracterización inmunológica en células de individuos infectados con el patógeno

ROVETTA, A; PEñA, D; HERNANDEZ DEL PINO, R; RECALDE, G; TATEOSIAN, NANCY; GUTIERRES, M; PALMERO, D; COLOMBO M; GARCIA, V

Mar del Plata

Congreso; LIX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC).; 2014

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) produce una enfermedad infecciosa que ocasiona 9 millones de nuevos casos y 1,4 millones de muertes anuales. Una apropiada respuesta inmune contra este patógeno requiere la generación de respuestas de citoquinas Th1, lo cual queda evidenciado en individuos con producción reducida de IFN-γ los cuales presentan manifestaciones severas de TB1. La infección efectiva de los macrófagos alveolares por Mtb conduce al desarrollo de numerosas funciones del sistema inmune del hospedador, pero inicialmente la bacteria es capaz de sobrevivir y persistir dentro macrófago. Así, Mtb logra interferir en la fusión entre fagosomas y lisosomas, modular la autofagia, la presentación antigénica y la respuesta inmune adaptativa de tipo Th1 entre otras acciones, mediante diferentes factores de virulencia como por ejemplo, el antígeno específico ESAT-6. ESAT-6 y CFP-10 son proteínas de secreción temprana de Mtb, y representan factores de virulencia de gran importancia para la bacteria. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales éstos operan no están completamente dilucidados. Los genes ESAT-6 (Rv3875) y CFP-10 (Rv3874) están codificados en la región de deleción 1 (RD1), presentes en la cepa patógena de Mtb pero ausentes en la cepa vacunal Bacillus Calmette- Guerin (BCG). Tanto ESAT-6 como CFP-10 pertenecen a la superfamilia de ESAT-6/WXG- 100, están regulados por el mismo promotor y son transcriptos al mismo tiempo. Ambos son secretados conjuntamente como un complejo 1:1 y poseen capacidad de disminuir los niveles de ROS en macrófagos e inhibir la activación T, interfiriendo con el correcto funcionamiento del sistema inmune. Se ha demostrado que frente a la utilización de las proteínas recombinantes individuales (ESAT-6 o CFP-10) la proteína de fusión posee parámetros termodinámicos elevados y mayor estabilidad biológica lo que la hace más adecuada para ser utilizada como herramienta de estudio. A su vez, investigaciones realizadas utilizando el complejo, han demostrado que el extremo carboxilo terminal de CFP-10 cumple un rol crucial en el mantenimiento de la virulencia de ESAT-6 y que su ausencia implica la disminución de la misma. Por esta razón, generamos una proteína de fusión (EC) ESAT-6/CFP-10, emulando al complejo que forman in vivo, para estudiar su inmunogenicidad y efecto sobre la autofagia en células de individuos con infección activa por Mtb (pacientes tuberculosos-TB) e individuos con infección latente (LTBI). En Argentina, hemos caracterizado dos poblaciones de pacientes con TB activa según la respuesta in vitro frente a un sonicado de Mtb: los pacientes Altos Respondedores (AR) presentan alta producción de IFN-γ, alta proliferación y expresión incrementada del receptor SLAM; mientras que los individuos Bajos Respondedores (BR) producen baja proliferación y niveles de IFN-γ y expresión de SLAM reducida. Resulta fundamental conocer los mecanismos inmunes del hospedador que permiten controlar la infección por Mtb y diferenciarlos de aquellos que conducen a enfermedad. Al respecto, la autofagia, es un proceso auto degradativo fundamental en la célula que controla la eliminación y re-utilización de componentes celulares, siendo de vital importancia en la homeostasis celular. A su vez, estudios recientes han descripto múltiples roles de la autofagia en la regulación de la muerte celular, la diferenciación y la respuesta antimicrobiana en mamíferos. La autofagia afecta las respuestas inmunes y su regulación responde a la presencia de microbios y la activación de citoquinas, entre otros factores. De hecho, este proceso que puede ser estimulado por citoquinas Th1 e inhibido por citoquinas Th2, fue descripto como una auténtica barrera contra la TB: protege contra la necrosis celular y la patología pulmonar, las dos claves de la enfermedad activa. Más aún, en modelos murinos se observó que la autofagia controla la infección TB in vivo y además previene una excesiva reacción inflamatoria en el hospedador. Por lo mencionado, al ingreso de Mtb al organismo el tipo de respuesta del hospedador conduciría a distintos patrones de expresión de citoquinas, modificando aquellos mecanismos de defensa regulados por las mismas, y llevando a desarrollo de enfermedad o contención de la infección (latencia). Así, el objetivo de esta línea de investigación es el estudio de la autofagia durante la infección tuberculosa humana y su regulación. En particular, en esta etapa analizamos la modulación de la autofagia por el complejo de virulencia EC conformado por ESAT-6 y CFP-10.