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Introducción:En los últimos años las nanopartículas de hierro han cobrado alto interés en camposcomo la medicina, la informática, textiles, plásticos, etc. Las nanopartículas puedenllegar al ambiente, con potencial impacto sobre la salud ambiental y humana. Seconsidera que el mecanismo citotóxico más importante que inducen losnanomateriales se relaciona con la generación de ROS, pudiendo derivar en procesosde estrés oxidativo. El análisis de la capacidad antioxidante total (TOSC) hademostrado ser una herramienta fiable para evaluar cuantitativamente la resistenciabiológica a la toxicidad de ROS. Este método se basa en la capacidad de losantioxidantes celulares para reducir la oxidación del ácido α-ceto-γ-metilbutírico(KMBA) a etileno en presencia de oxi-radicales generados artificialmente. La formaciónde etileno, que es parcialmente inhibida por la presencia de antioxidantes, esmonitoreada por GC (Winston et al 1998).Las lombrices son consideradas excelentes organismos para el monitoreo biológico decontaminantes del suelo (bioindicadores), por su rol en la incorporación ydescomposición de materia orgánica que favorecen el desarrollo y mantenimiento dela estructura del suelo. El ensayo de toxicidad en lombrices empleando el método delpapel impregnado, resulta útil para evaluar la toxicidad de los compuestos quepudiesen llegar al compartimiento suelo. Respuestas biológicas que ocurran aconcentraciones subletales pueden resultar parámetros más relevantes. Entre ellos,TOSC es un índice integrador para monitorear el impacto de los contaminantesambientales sobre las funciones celulares.Objetivos:Puesta a punto y evaluación de la capacidad antioxidante total (TOSC) contraperoxilos de material biológico en lombrices expuestas a nanopartículas de Fe2O3,utilizando la técnica espacio cabeza y cromatografía gaseosa.Materiales y Métodos:Material biológicoLombrices Eisenia andrei adultos, con clitelo desarrollado, de al menos tres meses deedad y pesos comprendidos entre 300-600 mg.PartículasSe utilizaron dos tipos de partículas de óxido férrico (Fe2O3): nanopartículas (tamañopromedio < 30nm) y partículas convencionales (tamaño promedio < 5 Nm). Sigma-Aldrich, Argentina.Bioensayos de exposiciónSe procedió de acuerdo con la guía OECD N° 207, utilizando la técnica del papelimpregnado. Lombrices adultas (5 ejemplares/tratamiento) fueron expuestas durante72 hs a papeles de filtro impregnados con suspensiones acuosas de las partículas (50y 100 Ng/cm2), en viales de vidrio y se almacenaron a -80 ºC hasta su procesamiento.Paralelamente se llevó un control con lombrices expuestas a papeles impregnadossólo con agua.Preparación de homogenatos y determinación de proteínasEntre 3 y 5 lombrices por tratamiento fueron homogeneizadas (1:3 w/v) en buffer TRISCl100 mM, pH 7.5. Los homogenatos se centrifugaron a 9.000 g 30 min (4 ºC). Lasproteínas se determinaron por la técnica espectrofotométrica de Bradford (1976).Evaluación de TOSCSe determina la cantidad de etileno liberada, por oxidación del KMBA, en relación alblanco en presencia y ausencia de muestras biológicas.Los radicales peroxilo se originaron por descomposición térmica del dihidroclorhidratode 2-2´-azo-bis-(2 metilpropionamidina) (ABAP) a 37°C en buffer fosfato de potasio100mM, pH 7,4 (Regoli and Winston 1999).Viales de 10 ml conteniendo 0,8 ml de KMBA (0.2 mM), 0,1 ml de ABAP (cf. 20 mM) y0,1 ml de homogenato se incubaron a 37 ºC. El etileno producido fue determinado porcromatografía gaseosa tomando alicuotas de 0,5 ml del espacio de cabeza de cadavial, cada 15 minutos durante un período de 90 minutos. El etileno generado en losviales fue determinado en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard (HP 6890 SerieN) con detector de ionización de llama empleando una columna Supelco Q-PLOT(30m x 0.53 mm). La temperatura del inyector fue de 180 ºC y la del detector de250°C. Se empleó nitrógeno como gas carrier a un flujo de 4,7 ml/min. El horno seprogramó a 35 °. La duración de la corrida fue de 6 minutos.La capacidad antioxidante total fue cuantificada por diferencia entre las áreas bajo lascurvas obtenidas para el blanco y las muestras.Análisis estadístico de los resultadosEl área bajo las curvas se determinó mediante el ajuste polinómico de los datos. Losdatos fueron analizados utilizando ANOVA de una vía y test de Tukey o métodos noparamétricos según corresponda.Resultados y ConclusionesSe observó que tanto los organismos expuestos a las partículas convencionales comolos controles presentaron niveles similares de TOSC. Los organismos expuestos a lasnanopartículas, en cambio, disminuyeron su capacidad antioxidante en un 20% y 28%respectivamente para ambas concentraciones.El análisis de estos resultados preliminares demostró que el método utilizado puedeser una herramienta robusta y versátil para la evaluación de efectos antioxidantes entejidos biológicos para evaluar el impacto de las nanopartículas que pueden serliberadas al ambiente.Agradecimientos: CONICET y ANPCyT.BibliografíaBradford (1976). Bradford M.M. 1976.A rapid and sensitive method for quantities ofprotein utilizing the principal of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248.Regoli and Winston (1999). Francesco Regoli, Gary W. Winston Quantification of TotalOxidant Scavenging Capacity of Antioxidants for Peroxynitrite, Peroxyl Radicals, andHydroxyl Radicals. Toxicology and Applied Pharmacology, 156, (2), 96-105.OECD N° 207. OECD (Organization for Economic Cooperation and Development)Earthworm acute toxicity tests, No 207. In OECD Guidline for testing of Chemicals.OECD, Paris, France, 1984.Winston 1998. Gary W. Winston, Francesco Regoli, Alton J. Dugas Jr., Jessica H.Fong, Kristie A. Blanchard. (1998). A Rapid Gas Chromatographic Assay forDetermining Oxyradical Scavenging Capacity of Antioxidants and Biological Fluids.Free Radical Biology and Medicine, 24 (3), 480-493.