Entrada de JUNV a células murinas 3T3 que expresan establemente el receptor humano DC-SIGN

FORLENZA, M. B.; ROLDAN, J. S.; MARTINEZ, M. G.; GARCIA, C. C.; CORDO, S. M.; CANDURRA, N. A.

Buenos Aires

Jornada; XXXIII Reunión Científica Anual - Sociedad Argentina de Virología; 2013

El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina, utiliza el receptor de transferrina humano para infectar a la célula hospedadora. Estudios previos demostraron que la presencia de proteínas altamente glicosiladas en la envoltura permite el reconocimiento y la internalización del virus por DC-SIGN (dendritic cell- specific ICAM-3 grabbing non- integrin). Esta lectina de tipo C se encuentra presente principalmente en células dendríticas. Distintos mecanismos de endocitosis son utilizados en las infecciones virales: en la vía mediada por clatrina, cuando el virus interacciona con el receptor las moléculas de clatrina lo hacen con las proteínas Eps15 y AP-2 y finalmente se ensambla una GTPasa dinamina que produce la fisión de la vesícula. El tránsito interno involucra endosomas tempranos que se mueven hacia la zona perinuclear. Estos presentan la proteína Rab5 que permite el transporte de la vesícula hacia endosomas tardíos y los últimos presentan una proteína Rab7 que regula la interacción con lisosomas. Diversos estudios demuestran que la vía involucrada para la entrada de patógenos a través de esta lectina es la dependiente de clatrina. Además, varios trabajos demuestran que la unión e internalización de HIV a DC-SGN depende de la organización de la misma en microdominios enriquecidos en colesterol. En estudios anteriores, se uitilizaron tratamientos con los inhibidores farmacológicos para la endocitosis (dynasore), para la vía dependiente de clatrina (dansylcadaverina) y para las vías dependientes de colesterol (metil- ß- ciclodextrina). En estos casos, tanto por los ensayos de producción viral por UFP como por inmunofluorescencia indirecta (IFI), se observó ihibición significativa de la entrada de JUNV. El objetivo de este trabajo fue continuar con ensayos que permitan determinar la vía endocítica utilizada por JUNV en células 3T3-DC-SIGN. En esta oportunidad, se utilizaron los compuestos cloruro de amonio y concanamicina A como inhibidores de la endocitosis y clorpromazina para la vía dependiente de clatrina. En este caso, además de determinar el efecto sobre la entrada de JUNV por las técnicas de rendimiento viral e IFI a las 24 hs, se realizaron ensayos de PCR en tiempo real a las 4 hs. En todos los casos, se observó inhibición entre 60 y 90% con respecto al control. Por otro lado, se realizaron transfecciones con construcciones salvajes y dominantes negativas para las proteínas EPS15, dinamina, Rab5 y Rab7. En estos ensayos se determinó por IFI la expresión de la nucleoproteína viral y se observó una inhibición entre el 70 y 90% para dinamina y Eps15, entre el 50 y 70% para Rab5 y no se observó inhibición de JUNV para Rab7. Los resultados obtenidos hasta el momento confirman que el mecanismo de entrada de JUNV en las células 3T3-DC-SIGN es la endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina, con cierta dependencia de colesterol, y que utilizaría endosomas tempranos para el transporte citoplasmático.