Influencia de la línea celular utilizada para la propagación del virus Dengue tipo 2 sobre las etapas tempranas del ciclo de multiplicación viral.

PICCINI, L.E.; ACOSTA, E.G.; TALARICO, L.B.; CASTILLA, V.; DAMONTE, E.B.

Buenos Aires

Jornada; XXXIII Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Virología; 2013

El virus del dengue (DENV), transmitido al hombre por los mosquitos del género Aedes, puede causar la fiebre del dengue o formas letales de la enfermedad. Actualmente no se dispone de vacunas ni de terapias antivirales y en este campo una estrategia interesante es el bloqueo de los pasos iniciales del ciclo viral. Se ha demostrado la dependencia del tipo celular a infectar y del serotipo viral en el mecanismo de entrada de DENV. En particular, DENV-2 entra a las células Vero por un mecanismo endocítico no clásico independiente de clatrina y caveolina, mientras que para infectar células de mosquito C6/36 utiliza la endocitosis mediada por clatrina. En la naturaleza DENV alterna ciclos de replicación entre células de mosquitos y humanas. Sin embargo, los laboratorios de investigación suelen producir los stocks virales en un único sistema celular. El objetivo de presente trabajo fue estudiar el efecto de la realización de diez pasajes seriados de DENV-2 en las células de mosquito C6/36 (M10), en las células de mamífero Vero (V10) y la alternancia en ambos tipos celulares (M5V5), sobre la entrada del virus a células Vero y analizar sus implicancias en la susceptibilidad a carragenanos con actividad antiviral que inhiben la adsorción e internalización de DENV. La participación de la endocitosis mediada por clatrina en la entrada a células Vero se estudió utilizando el inhibidor farmacológico clorpromazina y mediante la sobreexpresión de una mutante dominante negativa de la proteína Eps15. Luego de cuatro pasajes en células Vero el mecanismo de entrada del virus pasó a ser dependiente de clatrina, mientras que en M10 no se detectó alteración en la vía de entrada a la célula. En el caso de los pasajes alternados se observaron ciclos de susceptibilidad y de resistencia a la clorpromazina. El cambio en el modo de entrada no se relacionó con modificaciones en la glicoproteína E de envoltura, ya que no se encontraron mutaciones en V10 ni M5V5 y sólo M10, variante sin alteración en el mecanismo de entrada, presentó el cambio aminoacídico Q200R. Se evaluó la susceptibilidad de los pasajes frente a los carragenanos lambda e iota mediante un ensayo de reducción en el número de placas en células Vero. Ambos carragenanos mostraron potente actividad antiviral sobre el virus parental y M10. Por el contrario, la efectividad de los polisacáridos fue mucho menor contra M5V5 y V10, presentando ambas poblaciones virales resistencia antiviral frente a estos compuestos que afectan la entrada de DENV-2 a células Vero. En conclusión el pasaje seriado de DENV-2 en células Vero conllevó un cambio en la vía de entrada del virus, pasando de un mecanismo endocítico no clásico a uno dependiente de clatrina. Éste fenómeno tiene implicancias en el ensayo de la efectividad de compuestos antivirales que afectan etapas tempranas del ciclo viral, ya que los pasajes en distintos tipos de célula huésped pueden alterar la susceptibilidad del virus a dichos agentes. causar la fiebre del dengue o formas letales de la enfermedad. Actualmente no se dispone de vacunas ni de terapias antivirales y en este campo una estrategia interesante es el bloqueo de los pasos iniciales del ciclo viral. Se ha demostrado la dependencia del tipo celular a infectar y del serotipo viral en el mecanismo de entrada de DENV. En particular, DENV-2 entra a las células Vero por un mecanismo endocítico no clásico independiente de clatrina y caveolina, mientras que para infectar células de mosquito C6/36 utiliza la endocitosis mediada por clatrina. En la naturaleza DENV alterna ciclos de replicación entre células de mosquitos y humanas. Sin embargo, los laboratorios de investigación suelen producir los stocks virales en un único sistema celular. El objetivo de presente trabajo fue estudiar el efecto de la realización de diez pasajes seriados de DENV-2 en las células de mosquito C6/36 (M10), en las células de mamífero Vero (V10) y la alternancia en ambos tipos celulares (M5V5), sobre la entrada del virus a células Vero y analizar sus implicancias en la susceptibilidad a carragenanos con actividad antiviral que inhiben la adsorción e internalización de DENV. La participación de la endocitosis mediada por clatrina en la entrada a células Vero se estudió utilizando el inhibidor farmacológico clorpromazina y mediante la sobreexpresión de una mutante dominante negativa de la proteína Eps15. Luego de cuatro pasajes en células Vero el mecanismo de entrada del virus pasó a ser dependiente de clatrina, mientras que en M10 no se detectó alteración en la vía de entrada a la célula. En el caso de los pasajes alternados se observaron ciclos de susceptibilidad y de resistencia a la clorpromazina. El cambio en el modo de entrada no se relacionó con modificaciones en la glicoproteína E de envoltura, ya que no se encontraron mutaciones en V10 ni M5V5 y sólo M10, variante sin alteración en el mecanismo de entrada, presentó el cambio aminoacídico Q200R. Se evaluó la susceptibilidad de los pasajes frente a los carragenanos lambda e iota mediante un ensayo de reducción en el número de placas en células Vero. Ambos carragenanos mostraron potente actividad antiviral sobre el virus parental y M10. Por el contrario, la efectividad de los polisacáridos fue mucho menor contra M5V5 y V10, presentando ambas poblaciones virales resistencia antiviral frente a estos compuestos que afectan la entrada de DENV-2 a células Vero. En conclusión el pasaje seriado de DENV-2 en células Vero conllevó un cambio en la vía de entrada del virus, pasando de un mecanismo endocítico no clásico a uno dependiente de clatrina. Éste fenómeno tiene implicancias en el ensayo de la efectividad de compuestos antivirales que afectan etapas tempranas del ciclo viral, ya que los pasajes en distintos tipos de célula huésped pueden alterar la susceptibilidad del virus a dichos agentes.