OPTIMIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E A PARTIR DE MUESTRAS DE SALAME.

PISANO MB; RODRÍGUEZ G; FARÍAS AA; DI COLA G; MIRAZO S; NATES SV; RÉ VE

Buenos Aires

Congreso; II Congreso Internacional de Zoonosis. IX Congreso Argentino de Zoonosis. Alimentos y Zoonosis: Desafíos del Siglo XXI; 2018

Sociedad Argentina de Zoonosis

El virus de la hepatitis E (HEV) es un agente productor de hepatitis aguda principalmente, de transmisión fecal-oral, zoonótico: puede ser transmitido por cerdos, jabalíes y siervos (reservorios) a humanos. En otros países se ha descripto la transmisión alimenticia por consumo de carne cruda o mal cocida de estos animales o derivados (chorizo, salame) contaminada con el virus. En Argentina HEV fue detectado en humanos, ambiente y cerdos, aunque no se sabe el rol que cumplen los alimentos en su transmisión. En este trabajo se implementó y optimizó una técnica de detección de HEV a partir de salame (alimento derivado del cerdo de alto consumo crudo en nuestro medio), planteándose dos objetivos: 1-determinar si era posible la detección de virus a partir de la matriz del salame y obtener protocolo para su procesamiento; 2-implementar la utilización de un control interno (CI) exógeno que permita monitorear la eficiencia en cada tubo de reacción. Se utilizó como control positivo un transcripto de RNA HEV generado y cedido por el Laboratorio de Virología de la Universidad de la República (Uruguay), y un CI (RNA recombinante desnudo) generado y cedido por el Laboratorio de Hemoderivados-UNC (Córdoba, Argentina). Ambos RNAs fueron inoculados en rodajas de salame de entre 2 y 5 gramos (con incubación de 15 minutos) o agregados al medio de homogeneización, por separado y luego juntos en distintos ensayos. Para todos los casos, se realizó luego una homogeneización en mortero estéril, centrifugación a 10.000 rpm a 4°C por 20 min, extracción, retrotranscripción y amplificación genómica por nested PCR (HEV) o PCR en tiempo real (HEV y CI). Múltiples protocolos fueron probados, utilizando 2 medios de homogeneización: PBS y Trizol (Invitrogen); y 2 métodos de extracción: Trizol y columnas comerciales (Qiagen), realizando todas las combinaciones posibles, variando de a uno por vez. Para los ensayos con el CI (106 copias) se obtuvo la mejor recuperación (CT más bajos) utilizando Trizol para homogeneizar, kit comercial en la extracción e inoculando el CI en el medio de homogeneizado. Luego, se realizó el ensayo bajo estas condiciones inoculando rodajas de salame (para asemejar a una situación real) con 3 cantidades del RNA HEV: 106, 107 y 108 copias, obteniendo resultados positivos en los 2 últimos casos por la técnica de nested PCR y en todos los casos por PCR en tiempo real. Al inocular conjuntamente CI (106 copias)+HEV (107 copias) en una rodaja de salame, ambos marcadores fueron detectados.Los resultados mostraron que es posible detectar RNA HEV en la matriz alimenticia del salame, obteniéndose una metodología eficaz para ello. La detección del CI demostró que éste puede ser utilizado en este tipo de ensayos para monitorear la eficacia de la reacción. El no haber detectado 106 copias de RNA HEV por nested PCR podría indicar un bajo índice de recuperación del virus, lo que concuerda con reportes previos. A pesar de esto, haber detectado HEV posibilita el uso de esta técnica para la búsqueda del virus en alimentos de nuestra región, a fin de conocer el rol de los mismos como posible fuente de infección y contribuir en la prevención de su transmisión.