DESARROLLO DE UNA RT-NESTED PCR PARA LA DETECCIÓN DE TODOS LOS SUBTIPOS DEL VIRUS DE LA ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA.

PISANO MB; SÁNCHEZ SECO MP; RÉ VE; FARÍAS AA; CONTIGIANI MS; TENORIO A

Buenos AIres

Congreso; X Congreso Argentino de Virología III Simposio de Virología Clínica.; 2011

Sociedad Argentina de Virología

El complejo viral Encefalitis Equina Venezolana (EEV) consta de 6 subtipos serológicos (I al VI) clasificados en dos grupos: virus epidémicos/epizoóticos (subtipos IAB y IC), que emergen periódicamente afectando humanos y equinos; y virus enzoóticos (subtipos ID, IE, IF y subtipos II al VI), que circulan en nichos silvestres, capaces de causar enfermedad en el hombre pero no virulentos para equinos. En Argentina circulan Virus Río Negro (VRN, subtipo VI), asociado a enfermedad febril aguda con síntomas similares a Dengue, y Virus Pixuna (VPIX, subtipo IV). También se han detectado anticuerpos en humanos para los subtipos I y VI. Hasta el momento, para EEV sólo existían técnicas de PCR que detectaban los subtipos I-V, y el subtipo VI por separado. Por esto, se planteó desarrollar una RT-Nested PCR para detección de todos los miembros de EEV, teniendo en cuenta la circulación local de subtipos y las potenciales introducciones de nuevos subtipos (contemplando la reciente detección de subtipo ID en Bolivia). El diseño de primers se realizó en una región genómica conservada dentro del complejo EEV, pero distinta al resto de los alfavirus, correspondiente al gen nsP1; utilizando el programa Hint-PCR. Se seleccionaron primers degenerados para la RT-PCR (fragmento de 156 pb) y para la Nested PCR (fragmento de 80 pb). Las temperaturas de annealing, concentraciones de reactivos y parámetros de ciclado fueron estandarizados variando uno cada vez. Se evaluó especificidad incluyendo otros alfavirus: Encefalitis Equina del Este, Encefalitis Equina del Oeste, Virus Una y Virus Mayaro. El límite de detección se determinó realizando diluciones seriadas factor 10 de un stock de VRN de 6,5x10⁹ ufp, que fueron paralelamente inoculadas en placa (para determinación de las ufp). Todos los subtipos de EEV fueron amplificados con el set de primers utilizados, produciendo productos de correcta longitud, excepto el subtipo II (Virus Everglades), que presentó una banda inespecífica adicional. Los otros alfavirus incluidos resultaron negativos. El límite de detección correspondió a la dilución 10¯⁷ (última dilución en la que se visualizó amplificación), lo que corresponde a <500 ufp (2log de virus). Los resultados muestran que la PCR desarrollada puede ser utilizada para detección de miembros de EEV de manera específica y sensible. Esta es la primera técnica que detecta todos los subtipos de EEV en una sola reacción y contemplando la diversidad genética de los mismos. Se planea diseñar un control interno para esta reacción. Para Argentina, es de especial importancia la detección de los subtipos I, IV y VI, a fin de conocer el impacto de estos virus en la salud humana.