Estrategia de secuenciación de genoma completo del virus de hepatitis A por NGS

SICILIA, P; FANTILLI, A; CUBA F; POKLEPOVICH T;; RÉ V.; PISANO M B,; CASTRO G

Valle Hermoso, Córdoba

Otro; XLII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología ? SAV 2022; 2023

Sociedad Argentina de Virología

El análisis de genomas completos virales permite la identificación de variantes genéticas que pueden estar asociadas con cambios en la virulencia, transmisibilidad, escape a las vacunas, profundizar en el estudio de brotes y evolución viral, temas críticos en la vigilancia epidemiológica y la toma de decisiones en salud pública. Para el virus de la hepatitis A (HAV), agente bajo presión vacunal en Argentina, desde el año 2005, la información de secuencias locales disponibles es escasa y solo existe un genoma completo de HAV disponible hasta la fecha. El objetivo fue diseñar e implementar una estrategia de secuenciación del genoma completo de HAV mediante secuenciación masiva (NGS).Se diseñaron primers de 400 nucleótidos para el enriquecimiento de la muestra utilizando el programa Primal Scheme (https://primalscheme.com/), empleando como genomas de referencia las secuencias X83302 (secuencia de referencia HAV genotipo IA) y HM769724 (genoma completo de HAV de Argentina). Los primers fueron luego evaluados mediante los programas MEGA v11 y OligoAnalyzer (IDT). Para los ensayos se seleccionaron 6 muestras de plasma y 1 de materia fecal (MF), previamente positivas para HAV y secuenciadas en forma parcial, a las que se les realizó extracción de ácidos nucleicos mediante el kit Roche. Para la secuenciación por NGS se utilizó el kit COVIDseq en el equipo MiSeq (Illumina). Las secuencias obtenidas fueron analizadas por filogenia mediante el programa MEGA v11.Se obtuvo un set de 25 pares de primers, los cuales generan fragmentos de 400 pb que se solapan en aproximadamente 75 nucleótidos. Los mismos alinearon en las zonas esperadas y cumplieron todos los requisitos de un primer; doce de ellos tuvieron que ser degenerados. Cada par de primer fue evaluado de manera individual, obteniendo amplificación en todos los casos. Posteriormente se realizaron 4 pools de primers (de manera intercalada), obteniéndose amplificación específica en todos los casos. De un total de 6 muestras de plasma y 1 de MF se produjeron alrededor de XXXX de lecturas totales por muestra, con una profundidad de cobertura de todo el genoma de HAV que va de ¿??x a ¿??x (media de ¿?x). La cobertura de los genomas obtenidos correspondió al X%, X%, X%, X% y X% del genoma completo de HAV de 5 muestras de plasma y 1 de MF. El análisis filogenético mostró el mismo agrupamiento al obtenido mediante las secuencias parciales previas. En el presente trabajo se logró implementar una estrategia de secuenciación de genoma completo para HAV por NGS con enriquecimiento previo, obteniendo los primeros genomas completos de este virus de Córdoba, y posibilitando mayor acceso a la información de secuencias genómicas de nuestro país y de la región. Esto contribuirá a la vigilancia de HAV, particularmente importante en la era postvacunal, en un escenario de circulación viral cambiante.