Estudio de la vías señalizadas por metacaspasas: screening de interactores y evaluación de bibliotecas peptídicas en busca de sustratos naturales.

BOUVIER, L. A.; NIEMIROWICZ, G.T.; SALAS SURDUY, E.; PÉREZ, B.; CAZZULO, J.J.; ALVAREZ, V.E.

Rosario

Otro; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2013

La comprensión del mecanismo molecular por el cual actúan las metacaspasas, homólogos distantes de las caspasas de eucariotas superiores, es hasta el momento muy limitada, debido fundamentalmente a que se desconoce cuáles son los blancos de su actividad proteolítica. Es por ello que nos hemos dedicado a realizar una búsqueda de los sustratos naturales de estas enzimas, utilizando a Trypanosoma cruzi como organismo modelo, mediante dos aproximaciones complementarias: 1) el screening de un número de interactores (identificados por copurificación a partir de extractos de parásitos y posterior espectrometría de masas) bajo la hipótesis que un subconjunto de ellos podrían representar verdaderos sustratos y, 2) el estudio bioquímico detallado de la especificidad de sustrato sobre una biblioteca de péptidos por una técnica muy novedosa llamada PICS bajo la hipótesis de que podría aportar información valiosa acerca de la secuencia consenso de reconocimiento de estas proteasas. En este trabajo presentaremos resultados para dos potenciales sustratos identificados en el screening. Mostraremos la confirmación de los sustratos proteicos mediante ensayos de clivado in vitro utilizando las proteínas recombinantes purificadas, la identificación del sitio de clivado por secuenciación aminoterminal de Edman y la generación de mutantes en el sitio de clivado resistentes a la proteólisis. Los estudios de relevancia del clivado in vivo están siendo llevados a cabo actualmente y se mostrarán algunos resultados preliminares. Respecto del estudio bioquímico por PICS, mostraremos una primer serie de experimentos utilizando una biblioteca de péptidos generada a partir de proteínas de E. coli digeridas con GluC que confirmaron la especificidad de sustrato de las metacaspasas por residuos básicos en P1 y aportaron datos sobre preferencias en el resto de los subsitios (P6-P6´).