Estudio del sistema de SUMOilación en Trypanosoma brucei

IRIBARREN, P.; BERAZATEGUI, M. A.; CAZZULO, J.J.; BAYONA, J.C.; ALVAREZ, V.E.

Rosario

Otro; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2013

La SUMOilación es una modificación post traduccional reversible que involucra la unión covalente de una proteína estructuralmente relacionada con ubiquitina, SUMO, a una gran variedad de proteínas blanco, modulando su actividad, estabilidad y/o localización. En Trypanosoma brucei se ha demostrado mediante experimentos de knock-down que la presencia de SUMO es esencial para el parásito tanto en su estadio procíclico (PC) como sanguíneo (BS). Además, estudios recientes han demostrado la relación existente entre SUMO y el sitio de expresión activo de la glicoproteína variable de superficie, responsable de la evasión de la respuesta inmune en BS. El objetivo de este trabajo es identificar de manera global las proteínas SUMOiladas en el parásito mediante experimentos de proteómica para inferir, de esta manera, aquellos procesos que estarían siendo modulados por SUMO. Para esto hemos desarrollado una estrategia que involucra el reemplazo de los alelos que codifican para SUMO por una variante modificada que permite optimizar la purificación de las proteínas conjugadas e identificar el sitio de SUMOilación en un mismo experimento de proteómica. Esta estrategia anula la competencia con el SUMO endógeno y permite la expresión de esta versión de manera similar a la fisiológica. En base a estas construcciones hemos obtenido parásitos PC y BS con un doble reemplazo del alelo de SUMO. En ambos estadios, por inmunofluorescencia indirecta, se evaluó la expresión y localización subcelular de la versión de SUMO modificada observándose un patrón nuclear característico equivalente al observado en parásitos wild type. Además, se confirmó la capacidad de conjugación de la proteína de fusión generada mediante Western Blot, observándose bandas correspondientes a proteínas de alto peso molecular características de un patrón de SUMOilación. Actualmente nos encontramos purificando las proteínas SUMOiladas para realizar finalmente el análisis proteómico.