Avances recientes sobre las cisteina proteinasas de Trypanosoma cruzi.

JUAN JOSÉ CAZZULO; VANINA ALVAREZ; GREGOR KOSEC; JULIO CÉSAR BAYONA

Chascomús, Buenos Aires, Argentina.

Otro; XXII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología (SAP 2007).; 2007

Sociedad Argentina de Protozoología.

Trypanosoma cruzi contiene numerosas enzimas proteolíticas.  La reciente secuenciación de su genoma sugiere la presencia de 70 cisteina peptidasas, 40 serina peptidasas (ninguna perteneciente a la familia de la quimotripsina), unas 250 metalopeptidasas (en su mayoría homólogos de leishmanolisina), 25 treonin peptidasas y sólo dos aspartil peptidasas, ninguna de la familia de la pepsina.  El número total real es probablemente menor, debido a la presencia de alelos en muchos casos, y mas cercano al número de peptidasas predichas para Trypanosoma brucei y Leishmania major, alrededor de 160 en ambos casos.  Las cisteína peptidasas predichas pertenecen a 7 familias del Clan CA, a saber C1 (papaína), C2 (calpaínas), C12, C19 y C65 (enzimas deubiquitinantes), C51 y C54 (autofaginas);  3 familias del Clan CD, a saber C13 (GPI transamidasa), C14 (metacaspasas) y C50 (separasas);  y una familia en cada uno de los Clanes CE (C48, enzimas deSUMOilantes) y CF (C15, piroglutamilpeptidasa II).             En base a la información del Proyecto Genoma, nos hemos concentrado en la expresión y caracterización de peptidasas pertenecientes a tres de estas familias:  C54, C14 y C48. T. cruzi contiene dos metacaspasas, TcMCA3 y TcMCA5 (denominadas asi por su homología con dos de las presentes en T. brucei).  TcMCA3 está codificada por varios genes en tandem y se expresa en los cuatro estadios principales del parásito, en tanto que TcMCA5 está codificada por un gen de copia única y se expresa sólo en los epimastigotes.  Ambas enzimas están localizadas en el citosol, pero cuando se induce apoptosis por incubación de los epimastigotes con suero humano fresco, migran al núcleo.  Hasta ahora las evidencias de su participación en apoptosis son sólo indirectas, y estamos intentando demostrar su procesamiento in vivo e in vitro y determinar su actividad enzimática.El genoma del clon CL Brener de T. cruzi contiene dos genes codificantes de las autofaginas ATG4.1 y ATG4.2, y dos genes codificantes de la proteína similar a ubiquitina ATG8, 1 y 2, asi como los genes que codifican a las dos enzimas similares a E1 y E2 del sistema de ubiquitinación.  La proteína ATG8 funciona en levadura y en mamíferos en la formación de los autofagosomas, junto con otro sistema, el de la ATG12, que parece estar ausente en los trypanosomátidos.  Hemos expresado ambas ATG4 y ambas ATG8 como proteínas recombinantes en Escherichia coli, y demostrado que ambas autofaginas son activas in vitro.  ATG81 y 2 recombinantes son tambien procesadas  por extractos crudos de los cuatro estadios principales del parásito, y este procesamiento es inhibido por iodoacetamida.  Además, ATG4.1 y 2, y ATG8.1 fueron capaces de complementar mutantes nulas de levadura, indicando que son funcionales in vivo.  ATG8.1 tiene una localización difusa en condiciones normales, pero se concentra en vesículas, los autofagosomas, en condiciones de stress nutricional, que induce autofagia.El genoma de T. cruzi contiene un gen codificante de una proteína SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) y dos genes presumiblemente codificantes de la enzima activadora del SUMO y deSUMOilante.  Hemos expresado ya SUMO recombinante, y demostrado que en epimastigotes transfectados con la proteína ya activada, la misma se concentra en el núcleo.  Estamos intentando expresar las proteasas activas, e identificar las proteínas SUMOiladas, que parecen presentar un patrón diferente en los distintos estadios del parásito.