Nanoparticulas lipidicas nanoestructuradas

HIGA L; BRISKI A; HORACIO JEREZ; EDER L ROMERO; MARIA JOSE MORILLA

Congreso; Reunion Conjunta de Sociedades de Biociencias; 2017

SAIC

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), son caracterizadas por la inflamación crónica y descontrolada de la mucosa intestinal, además de los elevados niveles de especies reactivas de oxigeno (ROS) que se liberan durante la progresión de la enfermedad, lo cual contribuye al mantenimiento de la inflamación. Los tratamientos actuales, basados en drogas anti-inflamatorias, inmunosupresoras o agentes biológicos, apuntan a mantener la remisión de los episodios inflamatorios, pero suelen funcionar solo por tiempo limitado, acarreando múltiples efectos adversos sistémicos. Una estrategia para conseguir terapias más eficaces y seguras podría desarrollarse gracias al uso de nanomedicinas de administración oral. El uso de nanopartículas parece tener gran aplicabilidad en esta cuestión, debido a que estas pueden ser ingeniadas para ser dirigidas solo a las regiones inflamadas, teniendo en cuenta las características del tejido deteriorado (descenso del pH, depleción de la capa mucosa, incremento de la permeabilidad, presencia de cargas positivas). De esta forma se podría obtener una alta concentración de la droga solo en las regiones de interés, con una exposición mínima a los tejidos sanos, reduciendo así los efectos secundarios.En este trabajo de Seminario de Investigación de la carrera Licenciatura en Biotecnología, se describe la preparación y caracterización de nanopartículas arqueolipídicas nanoestructuradas (NAN), con núcleo compuesto por extracto de lípidos neutros (LN) y decorados con lípidos polares totales (LPT), extraídos del arquea hiperhalófila no alcalifílica, Halorubrum tebenquichense. Estas poseen carga superficial negativa y funcionan como ligandos de receptores scavangers de tipo A en macrófagos gracias a los LPT, poseen actividad antioxidante (AO) gracias al extracto de LN, y además portan el glucocorticoide anti-inflamatorio dexametasona (Dex).A partir de NLN de composición Compritol, Miglyol, fosfatidilcolina de soja (SPC) y Tween 80 (T80) (2; 2; 1,2; 3% m/m), preparamos NAN utilizando el método de homogenización-ultrasonicación, reemplazando el Miglyol por el extracto de LN y el SPC por LPT. Estas nanopartículas resultaron ultra-pequeñas (61 nm), con carga superficial negativa (-32 mV) y morfología esférica. Según el análisis térmico el índice de recristalización de las NAN fue menor (54%) que en las NLN (98,8%), mostrando una posible mayor eficiencia de encapsulación. El agregado de Dex a las muestras no afecto ni al tamaño medio ni al potencial ζ, y generó un aumento de su solubilidad en agua de 12 veces.Se determinó la actividad AO de las nanopartículas mediante métodos químicos (DPPH y ABTS). Las NLN no presentaron actividad AO, y las NAN y el extracto de LN mostraron igual capacidad AO, a pesar de que en el último caso las moléculas neutralizadoras de radicales libres (ROS) se encontraban formando parte del núcleo lipídico. A continuación, se determinó la estabilidad coloidal de las nanopartículas bajo condiciones gastrointestinales simuladas, donde se encontró que las NAN son más estables que las NLN.A concentraciones que no resultaron citotóxicas, las NAN fueron ávidamente más capturadas que las NLN en todos los tipos celulares ensayados (Caco-2, J774 A.1 y THP-1), y la presencia o ausencia de mucinas no generó cambios significativos. La actividad anti-inflamatoria de ambas nanopartículas se determinó cuantificando TNF-α e IL-1β sobre células THP-1 estimuladas con LPS. Ambas nanopartículas mostraron mayor capacidad anti-inflamatoria que la Dex libre, tanto digeridas como sin digerir, y no presentaron diferencias entre sí. La actividad AO in vitro se determinó tanto en J774 A.1 como en THP-1. En la primera línea celular las NAN disminuyeron las ROS en un 70%, y las NLN también lo hicieron, pero en menor medida. En las THP-1 nuevamente las NAN presentaron mayor poder AO disminuyendo un tercio los niveles de ROS, y las NLN no presentaron actividad. En los ensayos de co-cultivo con células Caco-2 y THP-1 en primer lugar se determinó la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), generado por las células Caco-2, donde se encontró que solo las NAN-Dex ayudan a reconstruir la barrera epitelial en células incubadas con LPS. Además, se determinó el efecto anti-inflamatorio y anti-oxidante sobre estas líneas celulares. Por un lado, sobre células THP-1 se cuantificó una disminución de 3 veces en los valores de TNF-a, tanto en las NLN-Dex como en NAN-Dex, y sobre las células Caco-2, se cuantificó una disminución a la mitad de IL-8. En cuanto a la actividad AO, la única que presentó capacidad para remoción de radicales libres fue la NAN-Dex, disminuyendo la liberación de ROS a la mitad sobre células THP-1. Finalmente, se comprobó la internalización celular en THP-1, corroborando así el pasaje de las nanopartículas a través de la capa de células epiteliales.En resumen, las NAN ultra-pequeñas, resistentes a los fluidos simulados y con carga superficial negativa, fueron ávidamente capturadas por todas las líneas celulares, mostraron tener actividad anti-inflamatoria gracias a la Dex incorporada y anti-oxidante gracias al extracto de LN que conforma parte del núcleo lipídico. Por estos motivos, consideramos a las NAN como posibles vehículos para futuras terapias contra las EII (Figura 1.1).