ARQUEOSOMAS ULTRADEFORMABLES: POTENCIALES AGENTES DE VACUNACIÓN POR VÍA TÓPICA

LETICIA H HIGA; PRISCILA SCHILRREFF; DIANA I. RONCAGLIA,; MARIA J MORILLA; EDER L. ROMERO

Lanús

Congreso; Congreso Argentino de Química; 2010

Asociación Química Argentina

Resumen:   Vesículas ultradeformables denominadas arqueosomas (A-UD) se prepararon a partir de lípidos polares totales (LPT) extraídos de arqueobacterias halófilas (género Halorubrum tebenquichense) aisladas de suelos Patagónicos Argentinos. Los A-UD administrados por vía subcutánea en un modelo murino produjeron mayor respuesta humoral y de memoria comparados con el adyuvante universal. La combinación de la capacidad adyuvante de los LPT y la facultad de atravesar el estrato córneo permitiría emplearlos como agentes de vacunación aplicados por vía tópica.   Diseño:    Las muestras de arqueobacterias crecieron en un medio de crecimiento basal  líquido: 20 % p/v NaCl, 0,4 % KCl, 2 % MgSO4, 1,3 % MgCl2, 0,1 % CaCl2, 0,02 % NaHCO3, 0,05 % KBr, suplementado con 0,5 % extracto de levadura, 1,5% casaminoácido, antiespumante (20 µl/L de medio de cultivo) y cloranfenicol (Anuar®, 30 mg/L de medio de cultivo) a  37º C. Los LPT se extrajeron de la biomasa con la mezcla cloroformo:metanol:agua (1:2:0.9; v:v), se recogieron por precipitación con acetona en frío (1). Posteriormente, se caracterizaron por cromatografía en capa delgada, mono y bidimensional, y se identificaron por espectrometría de masa por electrospray (ESI-MS). La composición de la mezcla lipídica resultó característica de las halobacterias (2), sus componentes mayoritarios fueron: fosfatidilglicerol (PG, m/z=805), fosfatidilglicerofosfato metil ester (PGP-Me; m/z=899), sulfoglicodieter (S-DGD-5; m/z=1055) y en menor proporción sulfoglicodieter esterificado con ácido fosfatídico (S-DGD-5PA; m/z=885*) y el bisfosfatidilglicerol (BPG; m/z=760*) (*especies bicargadas) Las vesículas se prepararon por hidratación de la película lipídica y posterior extrusión a partir de LPT, colato de sodio (ColNa) y fosfatidilcolina de soja (SPC) (3). Con el fin de caracterizar los arqueosomas, se determinó la concentración de lípidos (Método Bötcher) (4), el tamaño de las vesículas (Dynamic Light Scattering (DLS)), deformabilidad (forzando  el pasaje a través de membranas de 50 nm) (5) y su morfología y lamelaridad (TEM y Environmental-SEM).   Con el fin de encontrar el método de conservación óptimo las muestras se sometieron a tres procesos de secado: liofilización, evaporación máxima al vacío (EMV) y desecación al vacío, en cada caso se ensayó su capacidad de reconstitución que fue monitoreada mediante DLS y FTIR. Por otro lado, con el fin de observar la penetración de A-UD a través de la piel humana, se prepararon A-UD con doble fluoróforo, utilizando Rh-PE y HPTS. Posteriormente, fueron aplicados sobre la piel de origen quirúrgico en forma no oclusiva en diferentes puntos y se efectuaron crio-cortes observándose  con microscopio confocal láser de fluorescencia.     Además, se llevó a cabo un ensayo in vivo. A ratones Balb-c se los inmunizaron con A-UD con la incorporación de Ovoalbúmina (Ovo) como  modelo antigénico, vía tópica en un área de 2 cm2. Se administró una vez por semana durante un mes y un booster un mes más tarde.  La sangre se recolectó de la vena de la cola semanalmente y posteriormente en los sueros se determinaron los títulos de IgG, IgG1 e IgG2a por ELISA.   Resultados:   Los  A-UD presentaron las siguientes propiedades: a) Son vesículas unilamelares y ultradeformables de 100 nm de diámetro. b) La reconstitución es exitosa solo en el caso de ser deshidratados por EMV, incluso en ausencia de lioprotectores, conservan su tamaño y lamelaridad c) Penetran profundamente a través de la piel humana como se determinó por crio-cortes y microscopía confocal. d) Ovo atrapada en A-UD provocan respuesta de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a.   Conclusión:    Los arqueosomas ultradeformables (A-UD) demostraron poseer gran capacidad de penetración así como buenas propiedades adyuvantes (6) pudiendo ser empleados como nano agentes de vacunación tópica o distribuidores de material terapéutico a estratos más profundos de la piel.   Referencias:   (1) Kates, M. and Kushwaha, S. C. (S. DasSarma and E. M. Fleischman, eds) Isoprenoids and polar lipids of extreme halophiles. In Archaea: A Laboratory Manual, Halophiles, pp. 35–54. ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, NY. (1995).    (2) Corcelli A, Lobasso S: Characterization of lipids of halophilic Archaea. In Methods in Microbiology Extremophiles Edited by: Oren AFRaA. Amsterdam: Elsevier; 2006:585-613.   (3) J. Montanari, A.P. Perez, F. Di Salvo, V.Diz, R. Barnadas, L. Dicelio, F. Doctorovich, M.J. Morilla, E.L. Romero. Photodynamic ultradeformable liposomes: Design and characterization 330 (2007)183-194 International Journal of Pharmaceutics, sección Pharmaceutical Nanotechnology   (4) Bötcher, C.J.F.,Van Gent, C.M., Pries, C., 1961. A rapid and sensitive sub-micro phosphorus determination. Anal. Chim. Acta 24, 203–204.   (5) Cevc G. Material transport across premeability barriers by means of lipid vesicles. In: Handbook of Biological Physics, Eds. R. Lipowsky and E. Sackmann, Vol. 1, Chapter 9, pp 465-490. 1995   (6) Raul O Gonzalez, Leticia H Higa, Romina A Cutrullis, Marcos Bilen, Irma Morelli, Diana I Roncaglia, Ricardo S Corral, Maria Jose Morilla,Patricia B Petray and Eder L Romero. Archaeosomes made of Halorubrum tebenquichense total polar lipids: a new source of adjuvancy.  , BMC Biotechnology 2009, 9:71. doi:10.1186/1472-6750-9-71.