Evaluación de la capacidad de invadir células epiteliales mamarias bovinas de diferentes cepas de Staphylococcus aureus aisladas de infecciones intramamarias transitorias y persistentes.

PIROLA SI; PEREYRA EAL; VELÁZQUEZ N; BARAVALLE C; CALVINHO LF; RENNA MS; DALLARD BE

Esperanza

Jornada; VIII Jornadas de Investigación y Extensión (virtuales).; 2020

Facultad de Ciencias Veterinarias (UNL)

La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria (GM) en respuesta a una agresión local al tejido que puede ser de origen infeccioso, mecánico o tóxico. La gran mayoría de los casos de mastitis bovina se deben a infecciones intramamarias (IIM) causadas por microorganismos, principalmente bacterias, que invaden la glándula, se desarrollan y generan productos tóxicos perjudiciales para el tejido mamario. Esta enfermedad, es la más frecuente de las vacas lecheras y tiene efectos perjudiciales sobre el bienestar animal y la rentabilidad del establecimiento lechero1.Si bien la mastitis es causada por numerosos agentes etiológicos, Staphylococcus aureus es el patógeno contagioso más frecuentemente aislado de casos de mastitis, tanto en Argentina2, como en otros países de gran desarrollo lechero3. Este microorganismo posee la habilidad de invadir y sobrevivir dentro de diferentes tipos celulares, incluyendo células epiteliales mamarias, neutrófilos y macrófagos, lo que determina que no sea efectivamente controlado por las medidas preventivas y terapeúticas tradicionales. De esta manera, la forma de vida intracelular puede facilitar la persistencia de S. aureus en la GM, protegiéndose de los tratamientos antimicrobianos y de las defensas inmunes del hospedador ocasionando IIM crónicas y en muchos casos daños permanentes al tejido mamario3. Numerosos trabajos han sugerido que determinadas características fenotípicas y genotípicas de las cepas de S. aureus guardan relación con la capacidad de invadir las células de la GM. En este contexto, se han observado asociaciones entre la capacidad de formar biopelículas, la formación de cápsula, el grupo agr y la expresión de genes que codifican para proteínas superficiales (como las proteínas de unión a fibronectina) con la capacidad de adherencia e invasión de S. aureus en células epiteliales mamarias4. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de invadir células epiteliales mamarias bovinas de diferentes cepas de S. aureus aisladas de IIM transitorias (T) y persistentes (P) y seleccionadas en función de sus características fenotípicas y genéticas. Los ensayos se llevaron a cabo empleando 10 cepas de S. aureus con diferentes perfiles genéticos y capacidad de adaptación a la GM bovina. Las relaciones clonales entre los aislados se evaluaron en estudios previos mediante electroforesis en campos pulsados (PFGE). Además, para asegurar la diversidad genética, las 10 cepas fueron caracterizadas mediante genotipificación de ADN basado en microarreglos lo que permitió asignar cada cepa a un complejo clonal. Las cepas aisladas por única vez del cuarto mamario y que no fueron re-aisladas durante la lactancia en muestreos consecutivos mensuales luego del tratamiento antibiótico, fueron consideradas de baja adaptación a la GM bovina o T (cepas: 3, 17, 48, 179 y 806). Las cepas que fueron aisladas del mismo cuarto mamario durante tres o más muestreos consecutivos mensuales durante la lactancia en un periodo de 6 meses fueron consideradas altamente adaptadas a la GM bovina o P (cepas: 37, 316, 1595, 5011 y 5128). Los ensayos de invasión se efectuaron mediante el co-cultivo de las diferentes cepas de S. aureus con una línea de células epiteliales mamarias bovinas (Transformed mammary epithelial cells, MAC-T). Las monocapas de células MAC-T fueron infectadas con las cepas de S. aureus empleando una multiplicidad de infección (MOI) de 100:1 bacterias/célula. Las placas se incubaron durante 2 hs a 37°C en atmósfera de 5% de CO2 para permitir la adherencia e internalización de las bacterias. Posteriormente, se lavaron con una solución de PBS estéril y se incubaron 2 hs con medio de cultivo conteniendo gentamicina (100 µg/ml) a fin de eliminar las bacterias extracelulares. Post-incubación, las células fueron lavadas y lisadas con una solución de Tritón en agua destilada estéril. Finalmente se realizaron diluciones seriadas en base 10 de los lisados celulares y se sembraron en placas de agar sangre a fin de cuantificar el número de UFC internalizadas. El análisis estadístico de los datos se efectuó mediante ANOVA y post test de Tuckey utilizando el programa SPSS 11.0 para Windows. Se observó una gran variabilidad en cuanto a la capacidad de invasión para las diferentes cepas de S. aureus estudiadas. No se observó relación en la capacidad de invasión a la MAC-T y el origen de la cepa (T o P). La cepa 806 (T) mostró una capacidad de internalización significativamente menor a las demás cepas (p