Efecto del VIH sobre la osteoclastogénesis tras la infección aguda de sus precursores

SVIERCZ FRANCO; DELPINO M. VICTORIA; QUARLERI JORGE

Congreso; XL Reunión Científica Anual de la SAV 2022; 2022

Las personas infectadas con VIH presentan reducción de la densidad mineral ósea en comparación con la población general. Esto podría deberse a una alteración en la osteoclastogénesis, por acción viral directa y/o por mediadores que modifican el microambiente. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del VIH o sus mediadores en la osteoclastogénesis a partir de la infección de sus precursores.Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque PLUS, seguido de la purificación en gradiente de Percoll (pureza promedio: 80%). Se sembraron 2,5x105 monocitos/pocillo en placas x24, en medio estándar de cultivo + hM-CSF (30 ng/ml) por 3 días (37°C, 5% CO2). Los macrófagos derivados de monocitos (MDMs) obtenidos se infectaron con VIH-AD8 (R5) con inóculos de 1 y 0,01 pg de antígeno p24/célula, durante 4 h en medio libre de SFB. Tras lavar con PBS, se adicionó medio estándar de cultivo + hM-CSF 30 ng/ml, incubándose por 3 días (37°C, 5% CO2). Se cambió el medio de cultivo por medio completo a-MEM + 30 ng/ml de hM-CSM y 50 ng/ml de hRANKL, incubándose por 9 días, con reemplazo del medio cada 3 días. La eficiencia de infección se determinó mediante marcación intracitoplasmática del antígeno viral p24 (KC57, citometría de flujo), y la cinética de replicación viral por cuantificación de p24 en sobrenadantes de cultivo (ELISA, Murex). Los osteoclastos se identificaron por tinción con TRAP (fosfatasa ácida resistente a tartrato) y presencia de 3 o más núcleos; su número por campo se determinó por conteo al microscopio óptico (100X) de 10 campos diferentes. La viabilidad celular fue evaluada por citometría de flujo mediante marcación de AnexinaV-7AAD.La eficiencia de infección de los MDMs a los 12 dpi con VIH-R5 no mostró diferencias entre el inóculo de 1 pg/célula (57,87 ± 12,80%) y 0,01 pg/célula (46,06 ± 10,55%) (p>0,05). Esos inóculos exhibieron diferencias en la cinética de replicación viral tal que, sus máximos niveles se alcanzaron a los 6 dpi (2623 ± 2615 ug/ml) y 9 dpi (1422 ± 845 ug/ml), respectivamente, coincidiendo finalmente a los 12 dpi (1586 ± 793 ug/ml y 2204 ± 345 ug/ml), respectivamente.La génesis de osteoclastos exhibió una relación inversa con el inóculo viral tal que desafiando los MDMs con 1 pg/célula, el número de osteoclastos fue significativamente menor (8,80 ± 2,21) respecto del obtenido por infección con 0,01 pg/célula (22,57 ± 0,55), y el control sin infectar (28,60 ± 4,65)