Incorporación de antígenos de Babesia bovis en cuerpos de oclusión de baculovirus para el desarrollo de métodos de diagnóstico serológico por ELISA

PALLARÉS, H.M.; ALFONSO, V.; TABOGA, O; WILKOWSKY S. E; LOPEZ MG

caba

Congreso; Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virologia

Los baculovirus son virus de insectos usados principalmente en el control biológico de plagas y la expresión de proteínas recombinantes. La característica de estos virus de generar estructuras de resistencia llamadas cuerpos de oclusión (OBs o poliedros) conformados mayoritariamente por la proteína poliedrina (POLH) los hace especialmente atractivos desde el punto de vista biotecnológico, ya que a partir de fusiones traduccionales entre POLH y proteínas de interés se pueden generar poliedros quiméricos fácilmente purificables a bajo costo. Por otra parte, los microarrays de péptidos permiten un rastreo serológico rápido y económico de alto rendimiento de nuevos candidatos a ser incorporados a los OBs. Para integrar estos dos enfoques biotecnológicos trabajamos con el parásito Babesia bovis, uno de los agentes causales de la babesiosis bovina. El diagnóstico molecular actual de la infección con B. bovis incluye técnicas de ELISA que utilizan lisados de merozoítos obtenidos a partir de eritrocitos bovinos infectados, lo que resalta la importancia de producir antígenos recombinantes que reemplacen el uso de antígenos crudos. El objetivo principal de este trabajo es obtener poliedros que incorporen eficientemente péptidos antigénicos de B. bovis (paBb), aislarlos y caracterizarlos para su potencial uso en el desarrollo de un ELISA diagnóstico de la enfermedad. Para ello, se seleccionaron 5 paBb de 15 aminoácidos a partir de un microarray de péptidos. Posteriormente se diseñaron y obtuvieron 5 baculovirus que expresan cada paBb como fusión a POLH y un sexto virus que expresa dos repeticiones de cada paBb en seguidilla (TANDEM), también como fusión a POLH. Para asegurar la formación de poliedros que incorporen los paBb demostramos que es necesario el aporte de POLH salvaje, por lo que todos los virus presentaron una copia extra del gen POLH (aporte en cis) y se realizaron infecciones de líneas celulares que expresan induciblemente POLH (aporte en trans). Los poliedros quiméricos obtenidos bajo las condiciones de infección mencionadas fueron aislados y analizados en su composición de manera cualitativa por Western blot, demostrando en todos los casos la presencia de las proteínas de fusión. Los mayores rendimientos de poliedros quiméricos se obtuvieron cuando se infectó la línea celular empaquetadora Sf9POLHE44G con los baculovirus recombinantes, destacando la ventaja de una trans-contribución de una copia mutante de POLH. Finalmente, los paBb presentes en los poliedros disueltos fueron eficientemente reconocidos en ensayos de ELISA enfrentados con sueros de bovinos infectados, demostrando que la fusión a poliedrina no afectó su reconocimiento inmunológico, siendo la fusión POLH-TANDEM la que reconoció un mayor número de sueros positivos. En conjunto, estos resultados alientan el potencial uso de este sistema como herramienta de expresión y purificación de antígenos de interés para el desarrollo de tests de diagnóstico por ELISA.