Caracterización de microRNAs por RT-qPCR en aislamientos de Neospora caninum con fenotipo diferencial

LOPEZ ARIAS L; CAMPERO L; DELLARUPE A; RAMBEAUD M; VENTURINI M.C; MANACORDA C; FARBER M; WILKOWSKY S. E

Quilmes

Jornada; Primera Jornada Argentina de Biología de ARNs no codificantes; 2017

Asoc. Arg. Microbiol.-SAMIGE-Univ. de Quilmes

Neospora caninum es un protozoario intracelular del Phylum Apicomplexa que provoca abortos en bovinos y con una diversidad genética entre sus aislamientos con distinto grado de virulencia.Avances en el conocimiento de ARNs pequeños no codificantes muestran que estas moléculas regulan importantes procesos celulares asociándose a fisiología, infección e inmunidad en el caso de los parásitos. Estudios en Toxoplasma gondii (parásito filogenéticamente relacionado a Neospora ) muestran la existencia de un gran repertorio de miRNAs, que varían en abundancia dependiendo del aislamiento. Frente a esto, nos preguntamos si los miRNAs de N. caninum tendrían un rol especifico en la virulencia de distintos aislamientos. En el marco de un proyecto de análisis transcriptómico de 2 cepas de N. caninum con fenotipo diferencial hallamos una población abundante de pequeños ARN que podrían corresponder a miRNAs. Por lo que nos propusimos confirmar la presencia de estos miRNAs utilizando RT-qPCR como estrategia de detección y cuantificación. Con tal fín, y a partir de datos transcriptómicos obtenidos de T. gondii, se seleccionaron 4 familias de miRNAs (miR-15, miR-40, miR-60 y miR-61) para el análisis inicial. Por otro lado, se inocularon ratones con taquizoítos de N. caninum Nc-6 Argentina (virulencia moderada) y Nc-1 (virulencia alta) y a partir de tejidos de órganos seleccionados se los hizo crecer en cultivos celulares. Los parásitos fueron cosechados, resuspendidos en Trizol y extraído el ARN. Para la transcripción reversa se utilizaron cebadores diseñados específicamente en base a la secuencia nucleotídica de cada miRNA de N. caninum (obtenidas por ortología de datos de T. gondii) y cebadores que hacen blanco en el gen de actina. La PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green master mix, los cebadores miR-específicos, un cebador de secuencia universal y el ADN copia de cada cepa. Los resultados obtenidos mostraron que los 4 miRNAs evaluados se expresan en ambos aislamientos y que, en particular, miR-15 y miR-60 lo hacen de manera diferencial, con una mayor abundancia en la cepa de menor virulencia Nc -6 Argentina. En el caso particular de miR-60, nuestros resultados se contraponen a lo descripto en T. gondii ya que se observó una mayor expresión de este miRNA en una cepa virulenta respecto de otras de menor virulencia. En este trabajo se describe por primera vez la presencia de al menos 4 familias de miRNAs en cepas de N. caninum con fenotipo diferencial mediante el desarrollo de una RT qPCR. Estos resultados conforman un punto de partida para nuevas investigaciones acerca del rol regulador de los ARN no codificantes en la virulencia de los aislamientos de N. caninum.