Diagnóstico molecular por PCR de Trypanosoma evansi en equinos de la provincia de Formosa

DUBOIS F; PAOLETTA M; FLORENTIN A; RUSSO A; MONZON C; WILKOWSKY S. E

San Salvador de Jujuy

Congreso; XXI Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico; 2016

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Introducción. Surra es una enfermedad animal que ocurre en África, Asia y América Latina, causada por Trypanosoma evansi. Este flagelado se transmite mecánicamente por diferentes moscas hematófagas, tales como Tabanidae y Stomoxys, así como por el murciélago vampiro Desmodus rotondus. En Argentina se reportaron numerosos casos en la provincia de Formosa en las últimas décadas, atacando principalmente a equinos. La enfermedad se caracteriza por tener un curso agudo y crónico con fiebre intermitente, anemia, pérdida de peso, edemas, ocasionalmente trastornos locomotores y hasta la muerte de los mismos. El diagnóstico clínico de la infección por T. evansi sigue siendo difícil debido a que los signos son muy variados e inespecíficos. El diagnostico parasitológico como la microscopía directa y las técnicas de concentración tienen una limitada sensibilidad debido a que los niveles de parasitemia son fluctuantes, en particular durante las fases crónicas de la infección. El diagnostico serológico por medio de la detección de anticuerpos puede ser limitado a la hora de diferenciar animales enfermos de aquellos que hayan resuelto la infección a causa de que la prueba puede seguir detectando anticuerpos por períodos prolongados después de un tratamiento exitoso. Por todo lo dicho es que resulta imprescindible contar con una herramienta de diagnóstico adecuada para establecer la situación epidemiológica del T. evansi y aplicar medidas de control estratégicos. El objetivo de este trabajo fue poner a punto una PCR para T. evansi como prueba diagnóstica.Materiales y métodos.Se tomaron 10 ml de sangre de vena yugular de 31 equinos de establecimientos de cría extensiva ubicados a 80 km de la capital de la provincia de Formosa y se procedieron a guardarlas en tubos con y sin EDTA. Todas las muestras fueron evaluadas para determinar la presencia del parasito con la técnica de centrifugación del microhematocrito entre 12 y 24 hs de la extracción de las muestras (1). A partir del suero se realizó la técnica de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos anti-T. evansi, descripta por Monzón C.M. (2). Para la extracción de ADN genómico de sangre entera se utilizó el método de lisis con detergente (3). Para el diagnostico por PCR se utilizaron los primers descriptos por Konnai (4). Los primers utilizados fueron 5´-CTGAAGAGGTTGGAAATGGAGAAG-3´ (FORDWARD) y 5´-GTTTCGGTGGTTCTGTTGTTGTTA-3´ (REVERSE) y generan un amplicon de 151 pares de bases. Los primers se unen a una región conservada de la glicoproteína variable de superficie (VSG) de T. evansi. Para la reacción de PCR se utilizaron las condiciones de ciclado descriptas por el autor. Se utilizaron controles positivos y negativos adecuados. Los productos de la reacción fueron analizados en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. .En dos de las muestras positivas a la PCR-VSG se amplificó además por PCR una región hipervariable del gen 18SrRNA para su identificación por secuenciación. Con las secuencias obtenidas se realizó la búsqueda por BLASTn contra la base de datos de NCBI. Resultados. De los 31 equinos analizados, 10 (32% del total) resultaron positivos para la observación directa por microhematocrito mientras que 7 muestras (22% del total) resultaron positivas para la PCR-VSG. El ELISA detectó anticuerpos en 23 muestras (74% del total), de las cuales 6 fueron positivas también por microhematocrito. Las dos muestras secuenciadas mostraron 100% de identidad al fragmento del gen 18SrRNA de T. evansi luego de la búsqueda por BLASTn Discusión.La PCR-VSG resultó adecuada para la amplificación de aislamientos locales de T. evansi, lo que indica la conservación de las regiones blanco de los primers en las muestras analizadas. En función de los resultados, las diferencias de sensibilidad entre el microhematocrito y la PCR-VSG pueden deberse a un bajo rendimiento en el método de extracción de sangre entera utilizado, el cual podría ser mejorado extrayendo el ADN de la capa leucocitaria luego de centrifugar la sangre. La prueba ELISA a pesar de que indica únicamente la presencia de anticuerpos, aporto información epidemiológica indicando que la enfermedad estaría afectando a gran parte de los animales. Este trabajo constituye una primera aproximación al diagnóstico molecular de la presencia de tripanosomas equinos en Argentina. Estudios posteriores permitirán optimizar la PCR-VSG y determinar la distribución de T. evansi en la región.Bibliografía. 1. Woo,PTK, 1970.The haematocrit centrifuge technique for the diagnosis of African trypanosomiasis. Acta Trop. 27: 384?386. 2. Monzón C.M. 2000.Validación de una prueba inmunoenzimática indirecta para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma evansi en equinos de Argentina. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (3), 810-818. 3. Higuchi R. 1989. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: Erlich HA (ed). PCR technology principles and applications for DNA amplification, pp. 31-38. Stockton Press, New York4. Konnai, S., Mekata, H., Mingala, C.N., Abes, N.S., Gutierrez, C.A., Herrera, J.R.,Dargantes, A.P., Witola, W.H., Cruz, L.C., Inoue, N., Onuma, M., Ohashi,K., 2009. Development and application of a quantitative real-time PCRfor the diagnosis of Surra in water buffaloes. Infect. Genet. Evol. 9,449?452.