DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE TRYPANOSOMA VIVAX EN PEQUEÑOS RUMIANTES DEL ESTE DE LA PROVINCIA DE FORMOSA

FLORENTIN A; PAOLETTA M; DUBOIS F; MONZON C; WILKOWSKY S. E

San Salvador de Jujuy

Congreso; XXI Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico; 2016

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

IntroducciónLas enfermedades parasitarias de la sangre causan importantes pérdidas económicas en áreas tropicales, subtropicales y húmedas. Las de mayor impacto negativo en la producción pecuaria son aquellas causadas por hemoflagelados de la familia Trypanosomatidae. Estos agentes son responsables de un conjunto de síndromes de diversa severidad e intensidad clínica conocidos como tripanosomiasis. Las tripanosomiasis son causadas por especies del género Trypanosoma.Las especies de tripanosomas que afectan a los animales, con importancia económica en Sudamérica incluyen T. vivax y T. evansi. T. vivax es un hemoparásito de los rumiantes, originario de África que afecta bovinos, ovinos, caprinos, búfalos y cérvidos salvajes, ubicándose principalmente en sangre, linfa y ganglios linfáticos.En Argentina, el parásito fue hallado por primera en el año 2008 en bovinos y posteriormente en búfalos, produciendo una inmensa onda epizoótica que produjo numerosas muertes en las provincias de Formosa y del Chaco (Monzón et al., 2008). Hasta el momento, la presencia de estos parásitos en pequeños rumiantes no ha sido analizada en el país, lo que motivó la realización del presente trabajo.Los medios más comunes para detectar infecciones por T. vivax incluyen métodos parasitológicos y serológicos. Los primeros confrontan como principal inconveniente la baja sensibilidad en la medida en que la infección se vuelve crónica o la parasitemia se mantiene en bajos niveles. Los segundos tienen la limitante de que no son capaces de diferenciar entre una infección activa o una pasada, además de que existe la posibilidad de que ocurra reacción cruzada con otras especies de tripanosomas como T. evansi y T. theileri, con los que comparte similitud antigénica.Las técnicas de biología molecular, particularmente la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, ha permitido revelar infecciones en animales sintomáticos o asintomáticos sin parasitemia detectable, con gran sensibilidad y especificidad.El objetivo del presente trabajo fue comparar dos técnicas de PCR para la detección de T. vivax en pequeños rumiantes (ovinos y caprinos) de la provincia de Formosa, y de esta manera poder iniciar estudios epidemiológicos y de caracterización molecular en el país.Materiales y MétodosSe recolectaron muestras de sangre de vena yugular de 13 ovinos y 7 caprinos de diferentes sexos y edades. Los animales provenían de 2 establecimientos de pequeños productores de la localidad de Formosa, en la misma provincia. El primero se dedica a la actividad ovina y bovina, contando con 100 ovinos aproximadamente; y el segundo predio cuenta con ovinos y caprinos, de los cuales poseía, en el mes de marzo del 2016, un total de 52 ovinos y 70 caprinos, mientras que dos meses después y luego de una mortandad, se encontraron en el momento de la visita 19 ovejas y 48 caprinos. En ambos establecimientos se produjeron muertes y un porcentaje de los animales vivos mantenía un cuadro clínico febril, con mucosas pálidas y decaimiento al momento del muestreo.Se realizó la determinación de hematocrito y la prueba del microhematocrito para la observación directa del parásito (Woo, 1969). El ADN genómico se obtuvo a partir de 400 ul de sangre con la utilización del kit de extracción INBIO - ADN PuriPrep-S. Se realizó la PCR dirigida al gen PRAC (Proline Racemase) de T. vivax descripta por Fikru et al. (2014). Los primers utilizados fueron: 5?CGCAAGTGGACCGTTCGCCT3' (forward) y 5?ACGCGGGGCGAACAGAAGTG3? (reverse) los que generan un amplicón de 239 bp.Además se realizó una segunda PCR designada como CatL, descripta por Cortez et al. (2009) que amplifica secuencias correspondientes al dominio catalítico de enzimas Cathepsin L-like (CatL-like). Este dominio está ligado a la actividad enzimática, siendo estructural y funcionalmente conservado, lo que facilita la amplificación mediante PCR de un producto de 177 bp y permite un seguro alineamiento aún cuando se comparan organismos genéticamente distantes. Los primers utilizados fueron: TviCatL1 5´GCCATCGCCAAGTACCTCGCCGA3´ (forward) y el DTO155 5´TTAAAGCTTCCACGAGTTCTTGATGATCCAGTA3´(reverse)En ambas PCR se utilizaron las condiciones de ciclado descriptas por los autores. Se utilizaron controles positivos y negativos adecuados. Los productos obtenidos fueron analizados en gel de agarosa al 2% con Bromuro de Etidio.ResultadosLos resultados obtenidos muestran un hematocrito promedio en las 20 muestras, de 18,85% con un valor mínimo de 6% y un valor máximo de 29%. Solamente uno de los animales alcanzó un valor normal de hematocrito (29 a 55%).En las muestras analizadas, 11 (52,4%) resultaron positivas a la presencia del parásito durante la observación directa (OD). La PCR PRAC fue capaz de detectar 7 (33,3%) muestras positivas y la CatL 12 (57,1%). DiscusiónEl promedio del valor de hematocrito del total de muestras está por debajo de lo esperado y concuerda con los signos detectados en ambos rodeos, lo que advertiría la presencia de una enfermedad anemizante en ambos establecimientos.Las dos PCR realizadas funcionaron adecuadamente utilizando los primers y protocolos de ciclado reportados, lo que demuestra la conservación de las regiones blanco de los primers utilizados para ambos genes en cepas muy distantes geográficamente (CatL fue probada en cepas de Brazil, Colombia, Bolivia, Venezuela y de varias regiones de África; mientras que PRAC fue ajustada con cepas de Etiopía, Nigeria y Venezuela).Por otra parte, la PCR CatL pareciera ser más sensible que la PRAC, aunque estos resultados serán validados de forma estadística con el análisis de un mayor numero de muestras. Es menester implementar métodos diagnósticos de alta sensibilidad y especificidad, que confirmen la presencia de T. vivax en los rodeos de pequeños rumiantes debido a las pérdidas ocasionadas en estas actividades y a los riesgos de transmisión a otras especies susceptibles.Bibliografía1.Cortez AP, Rodrigues AC, Garcia HA, Neves L, Batista JS, Bengaly Z, Paiva F, Teixeira MMG. 2009. Cathepsin L-like genes of Trypanosoma vivax from Africa and South America-characterization, relationships and diagnostic implications. Mol Cell Probe, 23: 44-51. 2.Fikru R, Hagos A, Rogé S, Reyna-Bello A, Gonzatti MI, Merga B, Goddeeris BM, Büscher P. 2014. A proline racemase based PCR for identification of Trypanosoma vivax in cattle blood. Plos One, 9: e84819. 3.Monzón CM, Mancebo OA, Russo AM. 2008. Primera Descripción de Trypanosoma vivax en Argentina. Vet. Arg. XXV (247): 492-498.4.Woo PTK. 1969. The haematocrit centrifuge for the detection of trypanosomes in blood. Canad J of Zool, 47 (5): 921-923.