Desarrollo de un esquema de tipificación por secuenciación de locus múltiples (MLST) en Babesia bigemina

GUILLEMI E; RUYBAL P; DELFINO S; PRINCIPI D; FARBER M; WILKOWSKY S

Córdoba

Congreso; XXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

Sociedad Argentina de Protozoología

La babesiosis causada por el protozoario Babesia bigemina es una enfermedad hemoparasitaria de los bovinos que causa importantes pérdidas económicas a la ganadería.  El objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema de MLST para B. bigemina para estimar la estructura poblacional y la diversidad genotípica de aislamientos de distinto origen. Se identicaron 20 genes de B.bigemina por TBLASTN  contra los contigs del genoma utilizando como consulta los genes ortólogos de B.bovis. Luego de amplificar por PCR y secuenciar un fragmento promedio de 700 pb, se seleccionaron 6 en base a:- cantidad de sitios polimórficos; distribución por ortología en los cromosomas de B. bovis; ausencia de presión selectiva (dN/dS <1) y especificidad de los oligonucleotidos frente a ADNheterólogo. Los genes seleccionados fueron: cyp, dnaJ, rcc, sbp3, sbp4 y zfc. Se analizaron 7 cepas de referencia argentinas (M1A, M1P, M2P, S1A, S2A, S2P y S3P), 2 cepas de referencia extranjeras (México y Brasil atenuada),  1 caso clínico agudo de B. bigemina de Salta (M30) más un pasaje por ternero esplenectomizado (B38) y la cepa australiana virulenta del proyecto genoma. Se establecieron los haplotipos o “sequence type” (ST) resultantes de la combinación única de los alelos concatenados y se obtuvieron 9 STs diferentes para los 12 aislamientos analizados. La aplicación del  test de Chi cuadrado máximo para evaluar la recombinación intragénica arrojó un resultado negativo ( p>0.05). En consecuencia, los datos indican una estructura poblacional acorde al modelo clonal siendo la recontrucción filogenética el método adecuado de análisis. Utilizando Neighbour-Joining (programa MEGA 3.1) se otuvo  el árbol filogenético a partir de las secuencias concatenadas. El análisis del dendograma arrojó dos grupos bien definidos para las cepas de origen argentino que agruparon a  las cepas de carácter patógeno (M1P, M2P, S2P, S3P) separadas de aquellas atenuadas (M1A, S1A y S2A). Si bien las cepas no argentinas  no se agruparon junto con las locales,  la cepa brasileña se mantuvo  en el mismo clado que las atenuadas argentinas en cambio la mexicana permaneció en el mismo clado que las patógenas. En vista de estos resultados podemos concluír que el empleo de la técnica de MLST para Babesia bigemina es una herramienta útil para la discriminación de aislamientos de distinto fenotipos y origen geográfico y que su utilización a mayor escala con muestras de campo permitirá obtener información acerca de la distribución espacial de los genotipos presentes en nuestro país