-La inhibición de la vía de señalización celular Raf/MEK/ERK y su efecto sobre la síntesis de ARN y proteínas del virus Junín.

BRUNETTI, JESÚS EMANUEL; QUINTANA, VERÓNICA; SCOLARO, LUIS; CASTILLA, VIVIANA

Buenos Aires

Jornada; XXXVI Reunión Científica Anual de la SAV - AAM; 2016

62-La inhibición de la vía de señalización celular Raf/MEK/ERK y su efecto sobre la síntesis de ARN y proteínas del virus Junín.Brunetti, JE; Quintana, VM; Scolaro, LA; Castilla, V.Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad deBuenos Aires.En trabajos previos hemos demostrado que la infección con el arenavirus Junín (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina, provoca la activación de la vía de señalización celular Raf/MEK/ERK en cultivos celulares de distinto origen. El objetivo de este trabajo fue investigar cuál es el papel de esta cascada de señalización en los distintos eventos del ciclo de multiplicación de JUNV en cultivos de células Vero.A fin de determinar si el compuesto U0126, inhibidor de la activación de ERK, afectaba las etapas iniciales de la infección se cuantificó, mediante un ensayo de formación de placas (UFP), el virus adsorbido a 4°C en presencia o ausencia del inhibidor. Otra serie de cultivos infectados a 4°C se transfirieron a 37°C, en medio con o sin inhibidor, y a diferentes tiempos post-infección (p.i.) se cuantificó por UFP la cantidad de virus internalizado, utilizando clorpromazina como compuesto de referencia, ya que se conoce que dicha droga inhibe la entrada de este virus. Asimismo, para determinar el rol de ERK en el desnudamiento viral, células Vero infectadas con JUNV a 4°C fueron tratadas a distintos tiempos p.i. con U0126 o NH4Cl (como compuesto de referencia inhibidor del desnudamiento viral) por 3 h y luego se determinó la cantidad UFP obtenidas en cada caso. Ni la adsorción, ni la internalización o el desnudamiento fueron afectadas por U0126.Con el objeto de evaluar el efecto de U0126 sobre la síntesis de proteínas virales en un único ciclo de multiplicación, este compuesto se agregó a distintos tiempos p.i. en células Vero infectadas con JUNV y a las 14 h p.i. se cuantificó el rendimiento viral por UFP y la síntesis de las proteínas N y GPC ensayos de western blot. La adición temprana de U0126 provocó una marcada inhibición de la síntesis de ambas proteínas virales y los títulos virales se redujeron de manera significativa aún enaquellos cultivos tratados con U0126 durante las últimas 4 h de la infección. Por otra parte, se analizó la expresión de la proteína G1 mediante ensayos de inmunofluorescencia total y de membranadeterminándose que la inhibición de la vía afecta la síntesis de GPC pero no así su posterior tráfico a la membrana plasmática.Por último, a fin de establecer el rol de ERK en la síntesis del genoma viral, se analizó por qRT-PCR la síntesis de ARN viral genómico y antigenómico en células Vero infectadas con JUNV y tratadasdurante 14 hs con U0126 o ribavirina (utilizada como inhibidor de referencia de la síntesis de ARN).Mientras que la ribavirina disminuyó la síntesis de ARN genómico y antigenómico, el tratamiento conU0126 sólo produjo la disminución de la síntesis de ARN genómico.En conclusión, la caracterización del modo de acción de U0126 permitió determinar que la inhibiciónde la vía de ERK no afecta las etapas iniciales de la infección viral sino que inhibe la síntesis de macromoléculas virales.