Caracterización de la expresión de las ribonucleoproteínas heterogéneo-nucleares A/B en cultivos celulares infectados con virus Junín

MAETO, CYNTHIA A.; LINERO, FLORENCIA; SCOLARO, LUIS; CASTILLA, VIVIANA

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Se ha descripto que diversos componentes del núcleo celular participarían en la multiplicación de virus que replican en el citoplasma. En algunos casos la infección viral produce la acumulación en el citoplasma de dichos componentes y esta redistribución puede provocar la inhibición de la respuesta antiviral en la célula infectada o la modulación de su efecto citopático.  Algunas proteínas heterogéneo-nucleares (hnRNPs), que se localizan principalmente en el núcleo pero fluctúan entre núcleo y citoplasma interviniendo en el procesamiento, transporte y traducción de ARN mensajeros celulares, participarían en la replicación de diversos virus citoplasmáticos con genoma ARN. A fin de investigar la posible función de estos factores en la multiplicación de los arenavirus, en este trabajo se analizó la localización intracelular de las hnRNP del grupo A/B en cultivos celulares infectados con el virus Junín (JUNV) y el efecto del silenciamiento de la expresión de hnRNP A1 sobre la multiplicación viral. Se utilizaron células Vero infectadas de forma aguda y células BHK-21 infectadas de forma aguda o persistente (K3). En primer lugar se analizó, mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI), la expresión de las hnRNPs A/B (utilizando un anticuerpo reactivo contra las hnRNPs A1, A2-B y A3) y de la proteína viral de nucleocápside (N) en células BHK-21 infectadas con JUNV y en células K3. A las 24 o 72 hs post-infección (p.i.), las células BHK-21 que mostraban fluorescencia citoplasmática para la proteína viral N presentaron una disminución en la intensidad de la fluorescencia nuclear correspondiente a las hnRNPs. Asimismo, los cultivos K3 exhibieron menor nivel de fluorescencia nuclear en relación a las células BHK-21 no infectadas. Los cultivos K3 presentaron bajos niveles de producción de virus infeccioso presentando un título que resultó un 99% y un 99,99% más bajo que los títulos obtenidos a las 24 y 72 h p.i. en las células BHK-21. A las 24 hs p.i. sólo un 2,6% de las células BHK-21 expresaban la proteína N, mientras que a las 72 hs p.i. este porcentaje ascendía a  98,1%. En el caso de K3, el 100% de las células mostró una tenue expresión de la proteína viral. El análisis de lisados celulares mediante la técnica de Western Blot mostró que los niveles totales de expresión de las hnRNPs  en las células BHK-21 no infectadas o infectadas en forma aguda y en las células K3 eran similares. A diferencia de lo observado en las células BHK-21 y K3, no se detectaron alteraciones en la localización intracelular de las hnRNPs en células Vero infectadas con JUNV. Se evaluó además la importancia de hnRNP A1 en la multiplicación viral en células Vero y BHK-21, durante la etapa aguda de la infección, utilizando ARN de interferencia (ARNi) para silenciar la expresión de dicha proteína. Se utilizaron dos protocolos alternativos de lipotransfección y a las 24 hs post-transfección los cultivos se infectaron con JUNV. En las células Vero, estos tratamientos produjeron una reducción del 60% del rendimiento viral y de hasta un 70% en la expresión de N, determinada por IFI. El tratamiento con ARNi no afectó la producción de virus ni la expresión de la proteína N en los cultivos de células BHK-21. En conclusión, la infección con JUNV (aguda o persistente) produce una alteración en la localización intracelular de las proteínas hnRNP A/B en las células BHK-21 sin afectar los niveles totales de expresión de estas proteínas. Si bien en las condiciones ensayadas la infección viral en células Vero no provocó una alteración en la localización intracelular de las hnRNPs en células Vero, el bloqueo de la expresión de hnRNP A1 en esta línea celular inhibió la producción viral sugiriendo la participación de esta proteína en la multiplicación de JUNV.