Empleo del mutágeno 5-fluoruracilo y shock térmico en el estudio de la infección persistente del virus Junín in vitro

FERNÁNDEZ BELL FANO, PABLO; SCOLARO, LUIS

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología - Asociación Argentina de Microbiología

El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae y posee la particularidad de causar infecciones de tipo agudo y persistente, tanto in vivo como in vitro. En las células Vero, la persistencia se establece a las pocas semanas de iniciada la infección, una vez superado el efecto citopático provocado por el virus sobre el cultivo celular, estableciéndose un equilibrio entre el metabolismo celular y la replicación viral. Este tipo de infecciones se caracteriza por presentar síntesis y expresión continua de la nucleoproteína viral (N), producción de infectividad con títulos bajos alternada con períodos no virogénicos y resistencia a la sobreinfección con virus homólogo. Siendo la persistencia el fenómeno por el cual JUNV se mantiene en el medio ambiente resulta de interés el estudio de las condiciones y parámetros, tanto celulares como virales, implicados en su establecimiento y mantenimiento. Una de las estrategias, empleada por nuestro grupo a tal fin, es estudiar aquellas condiciones en las cuales dicha persistencia se vería impedida o desestabilizada. Con este propósito utilizamos el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU), droga que ha demostrado ser efectiva para inducir situaciones de mutagénesis letal para virus con genoma de ARN. El tratamiento con 5-FU (2 semanas, 5 mg/ml) se realizó al 3r día p.i. sobre células Vero infectadas con JUNV (cepa XJCl3) observándose una disminución, durante y luego del tratamiento, de los parámetros indicadores de infección: síntesis y expresión de N y titulo viral, detectados mediante Western Blot (WB) e inmunofluorescencia indirecta (IFI) y mediante plaqueo directo, respectivamente. Por otro lado, las células Vero persistentemente infectadas, ya sea tratadas o no tratadas, no presentaron diferencias significativas en los parámetros mencionados. En ensayos de sobreinfección con JUNV se observó que los cultivos infectados y tratados con 5-FU resultaron susceptibles mostrando títulos 2 log mayores que los obtenidos en cultivos sin sobreinfectar. Por el contrario, los infectados y no tratados fueron refractarios a la replicación viral, registrándose títulos similares a los cultivos sin sobreinfectar. Otro parámetro que demostró alterar el curso de la persistencia de JUNV in vitro fue el tratamiento prolongado de los cultivos a 39°C. Por este motivo se iniciaron estudios para determinar el efecto del tratamiento de shock térmico realizado durante la etapa aguda y persistente de infección empleando un esquema de tratamiento (44°C durante 20 min) que disminuyó la viabilidad celular en un 20% (técnica de MTT). Se realizaron ensayos de shock térmico en células sin infectar, persistentemente infectadas e infectadas 48h o 1h antes del tratamiento. Los ensayos de IFI y plaqueo directo no mostraron diferencias significativas en el porcentaje de células N (+) y en el título del sobrenadante de las células persistentemente infectadas o infectadas 48h antes. Por el contrario, las células infectadas 1h antes del tratamiento presentaron una disminución en el número de focos de células fluorescentes, de células por foco y en el título viral (1,2 log). El tratamiento con 5-FU resulta efectivo para reducir los parámetros indicadores de infección únicamente cuando es realizado durante la etapa aguda de la infección. Si bien no impide el establecimiento de la persistencia, imposibilita el surgimiento de la resistencia a la sobreinfección, debido probablemente a la reducción en la expresión de N. Del mismo modo, el tratamiento de shock térmico resultó efectivo sólo cuando se aplicó al comienzo de la infección. Ambos enfoques resultan adecuados para diferenciar distintos estadíos de la infección de JUNV in vitro.