Participación de la vía de la fosfatidilinositol 3-kinasa/protein quinasa B (PI3K/Akt) en la infección del virus Junín in vitro.

LINERO, FLORENCIA; SCOLARO, LUIS

Vaquerías, Córdoba

Jornada; XXVII Reunión Científica Anual, Sociedad Argentina de Virología, AAM; 2007

Sociedad Argentina de Virología, Asociación Argentina de Microbiología

La mayoría de los virus han desarrollado la capacidad de modular diferentes cascadas de señalización de la célula huésped para mejorar la eficiencia de su replicación. La vía de señalización de fosfatidilinositol 3-kinasa/ protein quinasa B (PI3K/Akt) atrae especial atención debido a su rol central en la modulación de diversas vías asociadas con la supervivencia, diferenciación, morfología y apoptosis celulares. Recientemente se demostró la participación de esta vía en la replicación efectiva de numerosos virus entre ellos, citomegalovirus humano (HCMV), coxackievirus B3 e influenza. El objetivo del presente trabajo es determinar la participación de la vía de PI3K/Akt en la infección aguda producida por el virus Junín (JUNV) in vitro. Para determinar si PI3K/Akt ejerce un rol en la replicación de JUNV se emplearon  compuestos inhibidores de distintos efectores de la vía: Ly294002, inhibidor específico de PI3K, rapamicina, inhibidor del complejo Raptor/mTOR y cafeína, inhibidor del complejo Rictor/mTOR. El efecto de tales compuestos se evaluó determinando la expresión de antígenos virales por ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y Western blot (WB) y producción de virus mediante ensayos de rendimiento viral en células infectadas y tratadas con dichos compuestos. Células Vero y BHK-21 mantenidas 24 hs. en medio libre de suero, fueron infectadas con la cepa XJCl3 de JUNV a una MOI de 0.8 y 8 UFP/cél respectivamente y tratadas durante 14 hs. con Ly294002 10µM (Vero) y 20 µM (BHK-21), cafeína 5mM y rapamicina 50nM. Los compuestos fueron usados en condiciones libres de suero. Las concentraciones empleadas fueron calculadas a partir de ensayos de viabilidad (MTT) tomándose las que mostraron una viabilidad >85%. La inhibición de PI3K por  Ly294002 mostró una disminución en la expresión de la nucleoproteína viral (N) determinada por WB de 70-80% tanto en células Vero como BHK-21, estos resultados se correlacionaron con los ensayos de IFI, donde se observaron valores similares de inhibición. Por otro lado rapamicina, inhibidor del complejo raptor/mTOR, mostró un efecto  menor en la expresión de N obteniéndose valores de inhibición de 50-60%  tanto por WB como por IFI, en ambas líneas celulares. También se evaluó el efecto de la cafeína, la cual impide la fosforilación de Akt mediada por rictor/mTOR, observándose una disminución en la expresión de N de 80-90% por WB, valores que se correlacionaron con los datos obtenidos por IFI. Sin embargo cabe mencionarse el efecto inespecífico de este último compuesto. Finalmente se determinó el efecto de estos compuestos en la producción de virus en células Vero infectadas con JUNV tratadas en las condiciones antes mencionadas, durante 14 hs. Los valores obtenidos fueron de 50-85% de inhibición de título viral respecto del control no tratado, la mayor inhibición fue observada para cafeína (85%). La regulación de la vía de señalización de PI3K/Akt ha mostrado ser clave en la replicación eficiente de muchos virus. Los resultados obtenidos en el presente trabajo  indican que dicha vía participaría en la replicación de JUNV, dado que la inhibición de diferentes efectores de la misma afectan la expresión de las proteínas virales, disminuyendo por tanto la eficiencia de replicación del virus. Por otro lado el efecto de los compuestos utilizados fue independiente de la línea celular empleada, dado que los resultados obtenidos fueron similares en células Vero y BHK-21. Estos datos sugieren que la vía de PI3K/Akt sería empleada por JUNV como estrategia para lograr su multiplicación eficiente.