Tesis de Doctorado: Caracterizacion de hongos fitopatogenos-toxicogenicos en productos frutihorticolas. El modelo Alternaria causante del enmohecimiento negro`en tomates cultivados en Argentina.

POSE G, PARDO AG, FERNANDEZ PINTO V

Universidad Nacional de Quilmes

Lugar: Bernal; Año: 2007 p. 300

Resumen     En nuestro país, el tomate es la hortaliza de mayor valor económico. Las especies de Alternaria son el agente causal del ‘enmohecimiento negro’ de frutos de tomate maduro, una enfermedad frecuente que causa importantes pérdidas en la producción de tomates. Asimismo, un tercio de los tomates ingresados para su comercialización en Argentina se pierden a causa de la pudrición por Alternaria. Las especies de Alternaria además del fruto afectan hojas, tallos y raíces. Durante la colonización del hospedador el patógeno puede producir muchos metabolitos tóxicos, mayormente fitotoxinas, las cuales juegan un rol importante en la patogénesis de plantas. Muchas especies de Alternaria han sido investigadas por su capacidad para producir metabolitos secundarios bioactivos y un gran número de moléculas con diferentes propiedades químicas y biológicas han sido descriptas.  Se conoce que tales especies son capaces de producir alrededor de 70 metabolitos secundarios tóxicos. Siete toxinas principales han sido reportadas como posibles contaminantes de alimentos. Ellas son Alternariol (AOH), Alternariol Metil Eter (AME), Altenueno (ALT), y Altertoxinas I, II y III (ATX I, ATX II, ATX III). Cuando ellas se acumulan en las partes empleadas como alimento pueden ser peligrosas tanto a la salud humana como animal. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue determinar y caracterizar las especies de Alternaria causantes de ‘enmohecimiento negro’ en frutos de tomate en nuestro país con el fin de desarrollar un modelo de caracterización de hongos fitopatógenos-toxicogénicos en productos frutihortícolas. Para ello se llevó a cabo un muestreo de diversas variedades de tomates afectados por ‘enmohecimiento negro’ procediéndose al aislamiento e identificación de las especies de Alternaria involucradas en tal patología. Se determinó también la capacidad toxicogénica de las mismas para la producción de las micotoxinas más comunes (AOH, AME y AT) y para la producción de toxinas específicas de hospedador, AAL. Asimismo se ha llevado a cabo la determinación de la incidencia de estas micotoxinas en productos de tomate producido y/o consumido en nuestro país. También se realizó la determinación de la patogenicidad y especificidad del huésped sobre las variedades de tomate comercializadas en la Argentina como también estudios de fitotoxicidad in vitro de los extractos crudos de los aislamientos obtenidos. Por otra parte, se ha determinado el efecto de los parámetros ambientales (aw, temperatura) sobre la germinación de esporas,  crecimiento y producción de toxinas de los aislamientos obtenidos. Por último, se llevo a cabo la determinación de la diversidad genética por AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) y secuenciación de genes. De los resultados obtenidos se concluye que A. tenuíssima es el principal grupo-especies asociado a ‘enmohecimiento negro’ de frutos de tomate, siendo A. alternata el segundo agente causal en orden de importancia. Asimismo, se determinó la presencia de aislamientos pertenecientes al grupo-especies A. arborescens, siendo este su primer reporte sobre estos frutos en nuestro país. Se ha podido determinar sobre un total de 32 aislamientos evaluados que el 75% de ellos produjeron AOH (40-400 mg/Kg), que el 69% produjeron AME (70-600 mg/Kg) y que el 56% fue capaz de producir AT (10-150 mg/Kg). Se observó la producción simultánea de estas toxinas en varios aislamientos. Todos los aislamientos pertenecientes al grupo-especies A. arborescens fueron capaces de producir las toxinas AAL. A partir de la evaluación de un total de 80 muestras de productos de tomate comerciales se determinó que el 49% de las mismas estaban contaminadas por toxinas de Alternaria. Alternariol fue encontrado en el 6% de los productos evaluados (187-8,756 μg/Kg), AME en el 26% (84-1,734 μg/Kg) y AT en el 29% de los mismos (39-4,021 μg/Kg). Asimismo, se determinó para los aislamientos un alto grado de patogenicidad sobre dos tipos comerciales de frutos de tomate (perita y redondo). Los extractos crudos mostraron un alto grado de actividad fitotóxica sobre semillas (respecto a la inhibición del desarrollo radicular y de brotes) y sobre esquejes de plántulas de tomate, poniendo de manifiesto el potencial de las especies de Alternaria para afectar diferentes partes de la planta. Respecto al estudio de la ecofisiología de Alternaria sobre sustrato tomate, se realizó mediante un diseño factorial donde fueron incluidas cuatro aw (0,98, 0,95, 0,92 y 0,90) y cuatro temperaturas (35, 21, 15 y 6 C). El menor tiempo de germinación (1,5 días) resultó a aw 0,98 a 21 y 35 C. La mayor velocidad de crecimiento (8,31 mm/día) fue registrada a aw 0,98 y 21 C. Sobre este sustrato, la mayor toxina producida fue AT. La condición óptima de producción resultó a aw 0,98 y 21 C. La mayor producción de AOH se registró  a aw 0,95 y 21 C y la de AME a aw 0,95 y 35 C. A aw tan baja como 0,90 no se detectó producción de ninguna de las toxinas evaluadas. A bajas temperaturas (6 C) solo se observó producción de AT. A partir de los análisis AFLP y de la secuencia de genes, los aislamientos  identificados como pertenecientes al grupo-especies A. arborescens (y productores de toxinas AAL) se han agrupado juntos en los correspondientes árboles de homología resultantes de los respectivos análisis, conjuntamente con el aislamiento de referencia A. arborescens EGS 39.128. Asimismo, aislamientos pertenecientes a los grupo especies A. alternata y A. tenuíssima se han agrupado juntos (incluyendo los aislamientos de referencia A. alternata EGS 34.016 y A. tenuissima EGS 34.015). Los porcentajes de similitud en la longitud de los fragmentos polimórficos y en la secuencia del gen evaluado (Histona 3) entre los aislamientos pertenecientes a cada uno de los tres grupo-especies mencionados ha sido 60/74% y 95% respectivamente. Los conocimientos adquiridos a partir del presente trabajo de Tesis respecto al género Alternaria y su hospedante (tomate) permitirán establecer acciones preventivas y correctivas para evitar la difusión del fitopatógeno y desarrollar estrategias de prevención y control para evitar las pérdidas y la contaminación de los frutos de tomate y sus productos con toxinas de este género.       El presente trabajo de Tesis fue realizado en el marco de los proyectos: UNQ/ I+D (Res. 059/02) "Desarrollo de Tecnologías en Alimentos" – 2002/2007 UBA/ UBACYT "Biodiversidad y control de hongos fitopatógenos y toxicogénicos en productos frutihortícolas"  (EX 278) – 2004/2007 UBA/ UBACYT "Biodiversidad, prevención y control de especies de Alternaria contaminantes de tomates cultivados en Argentina” (EX 825) – 2006/2009     Los resultados obtenidos a partir del mismo fueron previamente difundidos en: Publicaciones internacionales: Mycotoxin production by Alternaria strains isolated from tomatoes in Argentine. Pose G., Ludemann V., Fernandez Pinto V., Segura J. Mycotoxin Research. 20 (2): 80-86. 2004. Hans W. Schmidt Ed. ISSN 0178-7888   Occurrence of alternariol, alternariol monomethyl ether, and tenuazonic acid in argentinean tomato puree. Terminiello L.; Patriarca A.; Pose G.; Fernandez Pinto V. Mycotoxin Research 22 (4): 236-240. 2006. Hans W. Schmidt Ed. ISSN 0178-7888.     Presentaciones a Congresos:   1- "A. alternata de frutos y productos de tomate consumidos en nuestro país: Producción de AOH, AME y AT". Pose G., Ludemann V., Henriquez Moya M., Fernández Pinto V., Segura J. Presentación de póster “II CONGRESO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS – X JORNADAS ARGENTINAS DE MICROBIOLOGIA”, setiembre de 2003, Santa Fe   2- "Producción de AOH, AME, y AT por cepas de Alternaria aisladas de tomate a distintas temperaturas y sobre sustrato natural". Henriquez Moya M., Clavario C., Díaz I., Pose G., Ludemann V., Fernández Pinto V. Presentación oral “VI JORNADAS DE INGENIERIA EN ALIMENTOS”, octubre de 2003, Universidad Nacional de Entre Ríos, Entre Ríos.   3- "Producción de Ácido Tenuazónico por Alternaria spp aisladas de tomates y duraznos en Argentina". Díaz I., Fernández D., Henriquez Moya M., Pose G., Ludemann V., Fernández Pinto V. Presentación oral “VI JORNADAS DE INGENIERIA EN ALIMENTOS”, octubre de 2003, Universidad Nacional de Entre Ríos, Entre Ríos.   4- “Estudio de la calidad micológica de productos de tomate consumidos en nuestro país y determinación simultánea de ácido tenuazónico (AT) y ácido ciclopiazónico (AC) por HPLC”. Henriquez Moya M., Pose G., Fernández Pinto V., Segura J. Presentación de póster “CONGRESO INTERNACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS”, noviembre 2004, Córdoba.   5- “Alternaria spp en frutos de tomate: patogenicidad y especificidad del hospedante”. Pose G., Paoloni C., Vaquera S., Segura J. , Fernandez Pinto V., Pardo A. Presentación de póster “III CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS”, Noviembre 2006, Bs. As.     6- “Caracterización biológica de extractos crudos de cultivos de Alternaria: fitotoxicidad in vitro y actividad antimicrobiana”. Pose G., González V., Terminiello L., Segura J., Fernández Pinto V., Pardo A. Presentación de póster “III CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS”, Noviembre 2006, Bs. As.   7- “Influencia de la actividad de agua y la temperatura en el crecimiento de A. alternata aisladas de tomates afectados por black mould”. Pose G., Kyanko V., Patriarca A., Pollio ML., Segura J., Pardo A., Fernandez Pinto V. Presentación de póster “III CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS”, Noviembre 2006, Bs. As.   8- “Influencia de la actividad de agua y la temperatura en la producción de ácido tenuazónico por A. alternata aisladas de tomates afectados por Black Mould”. Pose G., Kyanko V., Patriarca A., Henriquez Moya M., Segura J., Pardo A., Fernandez Pinto V. Presentación de póster “III CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS”, Noviembre 2006, Bs. As.   9- A. arborescens specie-group en frutos de tomate afectados por enmohecimiento negro en Argentina. Pose G., Vaquera S., Lino N., Segura J., Pardo A., Fernández Pinto V. Presentación de póster “30 CONGRESO ARGENTINO DE HORTICULTURA – I SIMPOSIO INTERNACIONAL SOBRE CULTIVOS PROTEGIDOS”. Octubre 2007, Bs. As.   10- Influencia de la actividad de agua y la temperatura en la producción de micotoxinas por cepas de A. alternata aisladas de frutos de tomate. Pose G., Kyanko V., Patriarca A., Henríquez Moya M., Pollio M.L., Segura J., Pardo A., Fernández Pinto V. Presentación de póster “30 CONGRESO ARGENTINO DE HORTICULTURA – I SIMPOSIO INTERNACIONAL SOBRE CULTIVOS PROTEGIDOS”. Octubre 2007, Bs. As.     Dirección de Trabajos Finales para la carrera Ingeniería en Alimentos de la Universidad Nacional de Quilmes:   1- “Determinación de especies de Alternaria causantes de Black Mould en tomates, estudio de su capacidad toxicogénica y de la ocurrencia natural de sus micotoxinas mas comunes”. Alumna Margarita Henriquez Moya. 2005.   2- “Fitotoxicidad de especies de Alternaria aisladas de tomate cultivados en Argentina”. Alumnas Virginia Gonzáles y Celia Paoloni. 2006.   3- “Ecofisiología de las poblaciones de Alternaria causantes de “enmohecimiento negro” en frutos de tomate cultivados en Argentina”. Alumna Veronica Kyanko. 2007.     Subsidios obtenidos:   - Proyecto “Determinación de la capacidad toxicogénica para la producción de fitotoxinas hospedador específicas por aislamientos de Alternaria arborescens” Subsidio de apoyo a la investigación para estudiantes e investigadores en formación – Universidad Nacional de Quilmes. 2005.     Beca obtenida: -          IILA  (Instituto Italo Latinoamericano) Beca para realizar el estudio de diversidad genética - Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentare (ISPA) del Consiglio Nazionale delle Ricerche, Bari, Italia - Octubre de 2006 a Marzo de 2007