Microscopía Confocal de Exploración Láser para el estudio de Biofilms en tejidos de la vía aérea superior.

NATALIA ANGEL VILLEGAS, JULIO E. ARCE MIRANDA, ROQUE ROMERO DÍAZ, MARIO ZERNOTTI, MAGDALENA ROQUES REVOL, SEBASTIÁN PICCIAFUOCO, M. GABRIELA PARAJE.

Santander, España.

Congreso; X Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica.; 2009

Sociedad Española de Anatomía Patológica, Sociedad Española de Anatomía Patológica, Sociedad Española de Informática de la Salud, Sociedad Latinoamericana de Patología.

INTRODUCCIÓN: Los biofilms representan una comunidad de células sésiles que crecen unidas irreversiblemente a una superficie sólida, viva o inerte; embebidas en una matriz extracelular producida por ellas mismas, exhibiendo un fenotipo alterado con respecto al índice de crecimiento y transcripción de genes. Actualmente los biofilms son considerados factores de virulencia, puesto que constituyen un modo de crecimiento protegido, lo cual permite la supervivencia en un medio hostil, facilitando la unión de las bacterias a distintas superficies, ayudando al mantenimiento de las colonias y protegiéndolas de distintos factores, como los cambios en las condiciones ambientales, la posibilidad de ser fagocitadas por células macrofágicas del huésped, depredadas por otros protozoos o por el efecto de los agentes antimicrobianos. La Microscopia Confocal de Exploración Láser (MCEL) permite el estudio no destructivo del biofilms, haciendo un barrido del mismo en todo su espesor, posibilitando la obtención de planos a distintas profundidades con los cuales es posible reconstruir su estructura tridimensional. OBJETIVO: Los objetivos de este trabajo fueron utilizar MCEL para el estudio de biofilms microbianos en tejidos de la vía aérea superior, determinando la calidad y cantidad de biofilms presentes. También, aislar los distintos géneros bacterianos formadores de los mismos y estudiar la capacidad de formar biofilms “in vitro”. MATERIALES Y MÉTODOS: Se estudiaron adenoides y amígdalas de pacientes pediátricos y pólipos nasales de pacientes adultos, ambos grupos sometidos a cirugía. Los protocolos se encuentran aprobados por los comités de ética de las Instituciones intervinientes, con el correspondiente consentimiento firmado de los responsables de donar el material para este estudio. Los biofilms fueron observados mediante MCEL utilizando como colorantes una solución de yoduro de propidio (15μM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células bacterianas se tiñeron de rojo, seguida de una solución de 50 microgramos/ ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. Las cepas fueron aisladas de los tejidos por técnicas microbiológicas clásicas. La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos y su posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona, determinando la densidad óptica a 595nm (DO595nm). células bacterianas se tiñeron de rojo, seguida de una solución de 50 microgramos/ ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. Las cepas fueron aisladas de los tejidos por técnicas microbiológicas clásicas. La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos y su posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona, determinando la densidad óptica a 595nm (DO595nm). células bacterianas se tiñeron de rojo, seguida de una solución de 50 microgramos/ ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. Las cepas fueron aisladas de los tejidos por técnicas microbiológicas clásicas. La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos y su posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona, determinando la densidad óptica a 595nm (DO595nm). μM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células bacterianas se tiñeron de rojo, seguida de una solución de 50 microgramos/ ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. Las cepas fueron aisladas de los tejidos por técnicas microbiológicas clásicas. La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos y su posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona, determinando la densidad óptica a 595nm (DO595nm).595nm). RESULTADOS: Por MCEL, en los tejidos de los pacientes estudiados, se observaron tanto microcolonias como macrocolonias bacterianas formando biofilms, algunas de ellas como estructuras bacterianas mixtas; siendo Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Haemophylus influenzae, y Staphylococcus coagulasa negativo, los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. viridans, Haemophylus influenzae, y Staphylococcus coagulasa negativo, los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. viridans, Haemophylus influenzae, y Staphylococcus coagulasa negativo, los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Haemophylus influenzae, y Staphylococcus coagulasa negativo, los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. , los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. Cristal Violeta. Cristal Violeta. 595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: MCEL ha demostrado ser una herramienta de gran utilidad al momento de analizar la estructura tanto de la matriz exopolisacárida extracelular, como de las células que conforman los biofilms inmersos en tejidos de la vía aérea superior. Con las cepas aisladas se pudo corroborar esta capacidad de formar biofilms “in vitro”. Estos cuadros clínicos de la vía aérea superior, pueden tener relación directa con la presencia de microorganismos en forma de biofilms. Demostrar la presencia de los mismos, ayuda a confirmar la hipótesis de que las bacterias, protegidas de las defensas del huésped, en forma de biofilms, continúan con su metabolismo y la producción de exotoxinas locales, lo que favorecería la cronicidad de la respuesta inflamatoria evidenciable por los cambios en la mucosa respiratoria y la persistencia de infecciones que no responden a los tratamientos antibióticos.