Cuantificación por Microscopia Confocal de Exploración Laser (MCEL) de la actividad antifúngica y el estrés oxidativo de un compuesto antifúngico de origen natural sobre biofilms de Candida albicans.

MA DA SILVA, MA PERALTA, JL CABRERA, MG ORTEGA, MG PARAJE

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología ALAM-CAM 2016; 2016

Lasinfecciones de Candida asociadas a biofilms son clínicamente relevantes dado sualta resistencia a los fármacos de uso corriente, volviéndose imprescindible labúsqueda de nuevas drogas. En este sentido, el ácido úsnico (AU), un metabolitosecundario producido por la especie de líquenes Usnea amblyoclada, hademostrado efectos antimicrobianos en cultivos planctónicos de diversasespecies bacterianas y fúngicas. Sin embargo, su actividad sobre biofilms estámenos estudiada. Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que el AU tieneactividad anti-biofilm sobre Candida albicans y que el estrés oxidativo estáinvolucrado. El objetivo de este trabajo es profundizar dicho estudiocuantificando mediante MCEL el efecto de AU sobre biofilms de C. albicansevaluando el estrés oxidativo intracelular en las células sésiles.Compuesto:El AU fue purificado partir del extracto bencénico de líquenes del género UsneaMicroorganismos: C. albicans de origen bucal  resistente a fluconazol porsobreexpresion de transportadores de eflujo de tipo CDR1, CDR2 y MDR1 (CaR)(cortesía del Dr E. White, Washington University, Seattle, EE.UU).Tratamiento ATF: Las muestras fueron tratadas con AU 4 µg/ml.MCEL: La formación de biofilms y el correspondiente tratamiento antifúngico serealizó sobre discos de vidrio en microplacas de 24 pocillos. Posteriormente seeliminó el sobrenadante y las muestras se tiñeron con Calcofluor White (0.05%v/v) el cual tiñe de azul la pared celular permitiendo cuantificar la biomasa.La generación intracelular de especies reactivas de oxigeno (EROs), se estudiómediante tinción con la sonda 2?,7?-diclorodihdrofluorescein diacetato(DCFH-DA), la cual difunde a través de la membrana, es hidrolizada a DCFH poresterasas y finalmente oxidada al compuesto fluorescente DCF (verde) por acciónde las EROs (anión superóxido). Las muestras fueron tomadas con un MicroscopioFluoview FV1000 Espectral Olympus (Olympus Latin America, Miami, FL, USA),tomando revanadas ópticas de 1,2μm. Las imágenes fueron analizadas con elprograma NIH-ImageJ y el software COMSTAT.Elanálisis por COMSTAT mostró una disminución del 73% en la biomasa del biofilmtratado con AU (4.91µm3/µm2), con respecto al biofilm basal (18.39 µm3/µm2).Esto fue acompañado de una reducción en el grosor del mismo correspondiente aun 76.8% (de 21,9 a 4,81µm). En cuanto a la cuantificación del estrés oxidativointracelular, se obtuvo un valor de 0.78±0.06 para el biofilm tratado y0.46±0.05 para el biofilm basal. Las imágenes muestran una co-localizaciónevidenciada por un color turquesa, resultante de la mezcla de azul y verde.Estosresultados corroboran la actividad anti-biofilm del AU en una cepa de C.albicans resistente a FLZ, y evidencian que el estrés oxidativo estainvolucrado. Por lo tanto, alientan a seguir estudiando en profundidad elmecanismo de acción de este compuesto como posible alternativa para eltratamiento de infecciones por cepas de Candida resistentes a azoles.