INVESTIGADORES
ORTEGA Hugo Hector
congresos y reuniones científicas
Título:
Aspiración folicular guiada por ecografía de quistes ováricos bovinos, para la purificación de ARN total a partir de dichas muestras
Autor/es:
DIAZ, PU; VELAZQUEZ M; STANGAFERRO M; BERTOLI, J; PANZANI, CG; AMWEG A; SALVETTI NR; ORTEGA HH
Lugar:
Esperanza, Santa Fe
Reunión:
Congreso; XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas en Ciencias Veterinarias. Facultades de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de Rosario y Universidad Nacional del Litoral; 2011
Resumen:
La enfermedad quística ovárica se
caracteriza por la presencia de estructuras foliculares persistentes en el
ovario, asociadas con anovulación, infertilidad, y anestro en vacas; que ocasiona
cuantiosas pérdidas económicas1. Por esta razón, ha sido estudiada
extensamente en relación a su diagnóstico y tratamiento, sin embargo, en la
actualidad es exigua la información acerca de los mecanismos causantes de su
desarrollo. Por otra parte, aunque diversos estudios han caracterizado la
dinámica del crecimiento folicular, aún son escasos los conocimientos de las
modificaciones celulares y moleculares ocurridas en el folículo ovárico previo
al proceso de anovulación, ya que la mayoría de los estudios están realizados
sobre casos crónicos y muestras obtenidas en frigorífico. Es por ello que un
diagnóstico precoz de "casos a campo basado en el hallazgo de estructuras
foliculares mayores a 20 mm, en ausencia de CL y con pérdida de tono uterino2.
Permitiría hacer un seguimiento de la enfermedad, obteniendo material previo al
tratamiento que permita el estudio de los posibles mecanismos etiopatogénicos
de la misma. En el presente estudio, se propone extraer ARN total de células de
la granulosa, a partir de muestras obtenidas por aspiración folicular de
quistes ováricos bovinos. Para ello se utilizó un sistema de ultrasonido
digital Chison 8300vet equipado con un transductor microconvexo de 5,0 MHz
montado en una sonda transvaginal para aspiración folicular (Watanabe
Tecnología Aplicada Ltda., Cravinhos, Brasil). La misma posee una guía para la
colocación de una aguja calibre 20G con bisel ecogénico que se conecta por
medio de una tubuladura de teflón a tubos contenedores cónicos estériles de 50ml.
Para la aspiración se empleó una bomba de vacío a una presión de aspiración de
500mm Hg. Se utilizaron 5 vacas raza Holando Argentino en lactancia con
Enfermedad Quística Ovárica diagnosticada por ecografía. Una vez que el
dispositivo de aspiración fue montado, éste fue introducido vía vaginal hasta
contactar con el fondo de la misma, el quiste folicular fue localizado por
tacto rectal, acercado y fijado al transductor de la sonda. Una vez
visualizado, se procedió a la introducción de la aguja a través de la pared
vaginal y luego a través de la pared del quiste para la toma de muestra, al
mismo tiempo que la bomba de vacío fue activada. Inmediatamente luego de la
recolección del líquido folicular rico en células de la granulosa, se procedió
a su conservación a temperatura de refrigeración (4-6ºC) y se trasladó al
laboratorio. El volumen total de la muestra se dividió en alícuotas de 1,5ml en
crioviales estériles. Se centrifugaron, se retiró el sobrenadante y a cada tubo
con el precipitado celular se le adicionaron 750ul de Trizol®, conservándose en
nitrógeno líquido. Al momento de la extracción del ARN, se descongelaron las
muestras y se homogeneizó cada uno de los pellet. El ARN total se extrajo a
partir del sobrenadante obtenido con cloroformo y posterior precipitación con
alcohol isopropílico, a -20ºC. El ARN obtenido se lavó con etanol 75%, se
redisolvió con agua DEPC (0,1%) y se cuantificó por espectrofotometría a 260nm.
A los efectos de eliminar posibles contaminaciones de ADN genómico, se
realizó un tratamiento con ADNasa. Para la transcripción reversa primeramente
se preparó una solución conteniendo cebadores con secuencia al azar, dNTPs,
buffer de la enzima MMLV, DTT, ARNasaOut y la enzima MMLV Transcriptasa Reversa,
además de una cantidad constante de ARN tratado con ADNasa. Todas las
reacciones se llevaron a cabo en termociclador convencional. Posteriormente la
concentración de ADN copia (ADNc) obtenida fue cuantificada por un método
fluorimétrico (QubitTM, Invitrogen) con el objeto de utilizar luego una
cantidad constante para la técnica de amplificación del ADN (PCR). Finalmente y
para comprobar la eficacia de la extracción inicial del ARN a partir de células
granulosas obtenidas por aspirado folicular, se realizó la amplificación
específica de la secuencia codificante para la enzima CYP19 (Cytochrome P450,
aromatasa), cuya actividad y localización es específica de este tipo celular en
el folículo, empleando como molde el ADNc total. Los resultados demostraron que
es posible la extracción de ARN total de
células de la granulosa obtenidas por aspiración folicular de quistes
diagnosticados a campo, y que dichas muestras son viables de ser procesadas
luego de su conservación con Trizol® en nitrógeno líquido. De esta manera, el
material obtenido
por estos medios, haría posible el estudio de alguno de los mecanismos
etiopatogénicos de la enfermedad, teniendo en cuenta que se puede obtener una
anamnesis completa de estos casos a campo y conocer algunos factores que
pudieron haber influenciado en el trastorno anovulatorio.