Fosforilación regioselectiva de nucleósidos y azúcares catalizada por células de e. Coli bl21 que sobreexpresan fosfohidrolasas ácidas no específicas bacterianas

ROSARIO MEDICI; JUAN IGNACIO GARAYCOECHEA; ANA LAURA VALINO; ELIZABETH LEWKOWICZ; ADOLFO IRIBARREN

Mendoza

Simposio; XVII Simposio Nacional de Qca. Orgánica; 2009

Sociedad Argentina de Investigaciones en Química Orgánica

Las fosfohidrolasas ácidas no específicas bacterianas (NSAPs, en inglés bacterial nonspecific acid phosphohydrolases) son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar un amplio rango de compuestos estructuralmente no relacionados que poseen un enlace fosfoéster. Estas enzimas exhiben su actividad catalítica a pH ácido o neutro. Algunas NSAPs poseen actividad fosfotransferasa además de su actividad fosfohidrolasa intrínseca. Desafortunadamente, la actividad fosfohidrolasa domina sobre la fosfotransferasa y el uso de las NSAPs, en particular en la fosforilación de nucleósidos y azúcares, produce bajos rendimientos y tiempos largos de reacción. Los nucleósidos 5'-monofosfato naturales (NMPs) y sus análogos modificados son compuestos importantes debido a sus diversas aplicaciones como prodrogas de agentes antivirales y antitumorales, en estudios bioquímicos, y en la industria alimenticia. Por otro lado, los azúcares fosfato resultan de utilidad como intermediarios en la síntesis de diversos compuestos, entre ellos, los nucleósidos. Para incrementar la productividad de fosforilación de estos sustratos, y como una primera aproximación a la evolución in vitro, se desarrollaron dos cepas genéticamente modificadas de E. coli que sobreexpresan las NSAPs de Enterobacter aerogenes y Klebsiella planticola, respectivamente. La utilidad de estos dos nuevos microorganismos (E. coli BL21/petEapho y E. coli BL21/petKppho) fue analizada en la síntesis de diversos NMP (naturales y modificados) y azúcares fosfato. Las reacciones se llevaron a cabo en buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4, con pirofosfato ácido de sodio como dador de fosfato, 50 mg/ml (peso húmedo) de biocatalizador y el nucleósido o azúcar correspondiente. Los productos obtenidos fueron cuantificados por HPLC y/o métodos espectroscópicos. En el caso de los nucleósidos, se logró la fosforilación selectiva del oxhidrilo 5? en todos los compuestos analizados, entre ellos, adenosina, guanosina, inosina, citidina, uridina y fludarabina. Del mismo modo, se obtuvieron azúcares fosfato por fosforilación del oxhidrilo terminal de diversos monosacáridos de entre 3 y 6 átomos de carbono. En base a los resultados obtenidos, se pudo comprobar que los biocatalizadores generados poseen mayor actividad catalítica que las correspondientes cepas wild type, acortando considerablemente los tiempos de reacción. Asimismo, al disminuir la posibilidad de que los sustratos entren en caminos metabólicos alternativos, se produjo una mejora en los rendimientos.