Producción de una carboxilesterasa recombinante de Sphingomonassp. con actividad degradadora de pesticidas organofosforados

FRANCO ROSSI; JULIA SANTILLAN; AGUSTINA HERNANDEZ; ELIZABETH LEWKOWICZ; ADOLFO M. IRIBARREN; ROJAS, LORENA

Santiago de Chile

Simposio; IV Simposio Latinoamericano de Biocatalisis y Biotransformaciones; 2022

Universidad de Santiago de Chile

Los compuestos organofosforados (OPs) fueron sintetizados inicialmente hacia finales de la segunda guerra mundial como armas químicas y actualmente son empleados como pesticidas en la industria agrícola para el control de plagas y enfermedades de cultivos. Los OPs representan el 38% de los pesticidas utilizados alrededor del mundo y generan serios problemas de contaminación ambiental por ser altamente tóxicos. Estudios recientes indican niveles alarmantes de contaminación con OPs del suelo, de alimentos y del agua potable. Asimismo, en nuestro país, estudios epidemiológicos indican la existencia de casos de intoxicación humana por exposición accidental o intencional a plaguicidas OPs. Entre los principios activos utilizados en Argentina, el clorpirifos -OP triester- es el insecticida de mayor uso e impacto ambiental negativo.En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar metodologías confiables y económicas para la descontaminación ambiental de estos pesticidas. Los tratamientos convencionales físico-químicos generan nuevos desechos tóxicos y suelen ser muy costos, por lo que, la biorremediación –el uso de sistemas biológicos para el tratamiento de ambientes contaminados- surge como una alternativa de interés. Previamente en nuestro grupo de trabajo, se aisló una cepa de Sphingomonas sp.,a partir de una muestra de suelo agrícola que resultó ser eficiente para la degradación biológica de clorpirifos.En este trabajo, a partir de la secuenciación parcial de su genoma y mediante el empleo de estrategias bioinformáticas, se identificaron posibles genes codificantes para una enzima degradadora de OPs. Luego de un análisis exhaustivo, se diseñó una estrategia de clonado y expresión en E. coli BL21de estos genes, seleccionándose uno codificante para una carboxilesterasa- el gen 1492-, en función de su capacidad de degradar OPs. Posteriormente, este gen se clonó en el vector constitutivo de expresión en la levadura metilotrófica Pichia pastoris pGapαC, mediante el diseño de una estrategia para la exportación de la proteína al espacio extracelular. Luego de desarrollar los ensayos de expresión de varios clones obtenidos, se determinó que la carboxilesterasa expresada al medio extracelular presentó un peso molecular de 35 kDa– similar al peso previamente predicho in sillico- y que su actividad catalítica determinada mediante la cuantificación dela hidrólisis de OPs fue de 1,75 µmol min-1. La tasa de degradación obtenida al utilizar la enzima recombinante, fue el doble de lo reportado con la enzima producida a partir del microorganismo wild type. Asimismo, debido a que la producción de la enzima fue dirigida al medio extracelular, es posible su fácil recuperación y aplicación, respecto de las enzimas degradadoras de OPs wild type previamente reportadas, que suelen ser enzimas asociadas a membrana. Los resultados obtenidos en este trabajo, son promisorios para el desarrollo de sistemas de remediación de OPs mediante la aplicación de biocatalizadores recombinantes.