PURIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD COAGULANTE DE

TORRES NÁGERA, MA; FERNANDO F. MUÑOZ,; DOMINGUEZ, E; SONIA YESENIA SILVA BELMARES; MARÍA G. GUEVARA.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAProBio 2014; 2014

3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAProBio 2014.

PURIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD COAGULANTE DE LECHE DE UNA ASPARTIL PROTEASA DE SOLANUM ELAEAGNIFOLIUM (SeAP1) Torres, Manuel a; Muñoz, Fernando b; Dominguez, Enzo b; Silva, Sonia a; Guevara, M. Gabriela b a Laboratorio de Productos Naturales, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Blvd. Venustiano Carranza S/N, 25280, Coahuila, México. b Laboratorio de Bioquímica Vegetal, Instituto de Investigaciones Biológicas, IIB (UNMdP-CONICET), Funes 3250, 7600, Mar del Plata, Argentina gguevara@mdp.edu.ar Introducción Las proteasas son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos y, desde el punto de vista de la industria, son el tipo más importante de proteínas comercializadas en el mundo. Los campos de aplicación son muy diversos, incluyendo la ciencia y tecnología de alimentos, industria farmacéutica y de fabricación de detergentes (Aehle, 2004). Las proteasas de origen vegetal son utilizadas en diversos procesos de la industria alimentaria, tales como: la producción de quesos artesanales (Silva y Malcata, 2000, 2004; Fernández Salguero y col., 2003; Rocha y col. 2006), el tiernizado de carnes (Gerelt y col., 2000; Wada y col. , 2002), la industria cervecera (Loeffler, 1986; López y Edens, 2005) y la producción de péptidos biológicamente activos a partir de hidrolizados de proteínas lácteas (Guadix y col., 2000; Egito y col., 2007; Hernández Ledesma y col., 2013). En respuesta a las crecientes demandas mundiales de queso y de superar los problemas éticos asociados con la obtención de la enzima de origen animal (quimosina, una aspartil proteasa), existe un gran interés en la obtención de nuevas proteasas como fuente de enzimas para la producción de quesos (Johnson y Lucey 2006). Durante varias décadas, los frutos de la especie vegetal Solanum elaeagnifolium (Se), comúnmente denominada ?trompillo?, han sido utilizados en México como fuentes de cuajo para la manufactura de queso asadero artesanal (Martínez, 1979; Nee 1993; Gutiérrez y col. 2009; Lopez- Días y col. 2010). El objetivo de este trabajo fue purificar, identificar y analizar aspartil proteasas presentes en frutos de Solanum elaeagnifolium capaces de coagular leche bovina para su posterior uso como biocatalizadores de origen vegetal, para la generación de productos completamente adaptados (específicamente quesos) en la industria láctea. Metodología Purificación de SeAP1. La purificación de SeAP1 a partir de frutos de trompillo fue llevada a cabo según lo descrito por Guevara y col. (1999). Los frutos liofilizados fueron homogenizados con dos volúmenes de 100 mM acetato de sodio, pH 5.2; 4 mM DTT y 2.5 mM metabisulfito de sodio. Posteriormente, el homogenato fue llevado a un 80 % de saturación con sulfato de amonio y el precipitado fue sometido a una cromatografía de intercambio iónico Q-Sepharose en FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Finalmente, las fracciones con actividad proteolítica fueron reunidas y sometidas a una cromatografía de afinidad Sepharose-pepstatina A (Sigma, St. Louis, MO, USA). El tamaño de la proteína purificada fue estimado mediante cromatografía de exclusión molecular en FPLC utilizando una columna Superose 12 HR (10/30) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrada en buffer 50 mM Acetato de Na, pH 5.2 a un flujo constante de 1 mL/min y temperatura ambiente. Fueron colectadas fracciones de 1 mL y la elución fue monitoreada a 280 nm. Determinación de la actividad proteolítica. La actividad proteolítica fue determinada utilizando como sustrato hemoglobina parcialmente hidrolizada de acuerdo a lo descrito por Orlowsky y col. (1984). Se definió una unidad proteolítica (U) como la cantidad de enzima capaz de incrementar en 0.1 unidades la absorbancia a 750 nm luego de 1 h de incubación a 37 °C. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS. El análisis de la pureza de la proteína purificada fue realizado mediante geles de poliacrilamida 12 % en condiciones desnaturalizantes (SDSPAGE) (Laemmli, 1970). Las proteínas presentes en el gel fueron teñidas con Coomassie Brillant Blue coloidal (Neuhoff y col., 1988). Para los ensayos de Western blot la muestra fue sometida a SDS-PAGE y posteriormente el gel fue transferido a una membrana de nitrocelulosa en una celda de transferencia