Proteínas antimicrobianas: importancia de la citotoxicidad selectiva en proteínas aisladas de papa.

• MUÑOZ F, MENDIETA J., PAGANO M, DALEO G. Y GUEVARA M.

Mar del Plata

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa y VI Seminario Latinoamericano de Uso y Comercialización de la Papa; 2008

ProteInas antimicrobianas: importancia de la citotoxicidad selectiva en proteinas aisladas de papa.   Muñoz F.1, Mendieta J.1, Pagano M.1, Daleo G.1,2 y Guevara M1.   1Instituto de Investigaciones Biológicas, Universidad Nacional de Mar del Plata, CONICET. Funes 3250 4º Piso, Mar de Plata, Argentina. 2 CIC. gguevara@mdp.edu.ar   Introducción El interés de la utilización de los AMPPs (péptidos y proteínas con actividad antimicrobiana) en programas de mejoramiento vegetal se debe a que en actualidad, el alto costo ambiental y económico originado por la utilización de compuestos químicos para la fertilización y el control de enfermedades en los cultivos, a llevado a considerar a la biotecnología, como una alternativa para la producción de plantas con alto grado de resistencia a enfermedades [Selitrennikoff, C.P. (2001); Terras, F. Y.  et al. (1995) ; Parashina, E. (2000); Wang, Y. et al. (1999); Gao, A. et al. (2000)]. Varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de AMPPs en algunas especies conduce a un aumento del grado de resistencia a la infección por patógenos [Terras, F. Y.  et al. (1995) ; Parashina, E. (2000); Wang, Y. et al. (1999); Gao, A. et al. (2000)]. Por otra parte, la utilización de los AMPPs en medicina como "antibióticos naturales" se basa en que, en la actualidad existe una necesidad urgente de buscar alternativas a los antibióticos sintéticos. Esto es una consecuencia del continuo uso de antibióticos que ha tenido como resultado cepas bacterianas con resistencia múltiple a los mismos y como es de esperarse, complicaciones a la hora de enfrentar el control de enfermedades infecciosas y en especial de enfermedades intrahospitalarias, el cual es aún un problema sin resolver y que se acrecienta día a día [Mainous and Pomeroy, (2001)]. Las StAPs (aspartil proteasas de Solanum tuberosum) integran el grupo de AMPPS. Estas proteínas presentan actividad citotóxica selectiva, ya que causan la muerte de organismos patógenos de papa como el hongo Fusarium solani y el oomycete Phytophthora infestans, pero no de células de tabaco [ Guevara, M.G. et al. (1999); (2001); (2002); (2004); (2005); Mendieta et al. (2006)]. Conjuntamente, se ha reportado que las StAPs inhiben de manera irreversible el crecimiento de cultivos de cepas bacterianas patógenas de humanos, tales como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus, pero no son capaces de lisar glóbulos rojos humanos [Mendieta, J. et al. (2004)]. Estas proteínas poseen en su secuencia de aminoácidos un dominio interno denominado “Inserto Específico de Plantas” (StAsp-PSI) [Mendieta, J. et al. (2006)], el cual presenta homología estructural con un grupo de proteínas con capacidad de interactuar con lípidos, las “saposin-like proteins” [Simôes, I. and Faro, C. (2004)], que incluye a las saposinas A, B, C, y D; NK-lisina y granulisina, entre otras [Liepinsh, E. et al. (1997); Stenger, S. et al. (1998)]. Las saposinas están involucradas en la degradación lisosomal de esfingolípidos [Vaccaro, A.M. et al. (1999); O`Brien, J.S. and Kishimoto, Y. (1991)], las NK-lisinas poseen actividad antibacteriana y capacidad de lisar células tumorales pero no son capaces de provocar lisis en glóbulos rojos [Ruysschaert, J.M. et al. (1998)] y las granulisinas poseen actividad antimicrobiana [Gamen, S. et al. (1998)] y antitumoral [Thevissen, K. et al. (1999)]. El objetivo de este trabajo fue aportar conocimientos sobre el mecanismo de acción de las StAPs, determinando la actividad citotóxica de la proteína StAsp-PSIr, para finalmente generar nuevas herramientas para el tratamiento de enfermedades infecciosas en los cultivos y en el hombre. Materiales y Métodos Para llevar a cabo los objetivos propuestos, las proteínas StAP1; StAP3 y StAP-PSIr fueron purificadas a homogeneidad a partir de hojas y tubérculos, respectivamente [Guevara, M.G. et al. (1999); (2001); Muñoz, F.F. (2006)]. Las suspensiones de S. aurus, E. coli y B. cereus fueron tratadas con distintas concentraciones tanto de StAP1 como de StAP3 (1.3 μM, 1.8 μM, 3.8 μM, 7.5 μM y 10 μM) y de StAP-PSIr (0,35 μM, 0,71 μM, 2,14 μM o 2,85 μM) durante 6 horas a 37ºC. Posteriormente se sembraron en medio fresco con el fin de cuantificar las unidades formadoras de colonias [Stenger, S. et al. (1998)]. El IC50 (concentración de proteínas con la cual se observa el 50% de citotoxicidad) fue determinado por extrapolación de la curva dosis respuesta. Paralelamente, eritrocitos humanos frescos fueron tratados con las mismas concentraciones de las tres proteínas cuantificándose posteriormente la liberación de hemoglobina [Cesari, A. et al. (2007)]. Resultados Tabla1: Actividad antimicrobiana de StAP1, StAP3 y StAsp-PSIr sobre microorganismos de papa y de humanos.     * Concentración de proteína requerida para reducir la viabilidad de los microorganismos en un 50% (IC50) calculada a partir de las curvas dosis respuesta obtenidas luego de 20 (A) y 6 (B) horas de incubación, respectivamente. Los valores no fueron significativamente diferentes entre si (p <0.01).                                                                                    A IC50 (mM)*   StAP-PSIr StAP1 StAP3 F. solani 2,5 2,5 7,75 P. infestans 0,2 5x10-3 0,37     B       S. aurus 2,67 1,01 3,85 B.cereus 0,24 3,2 1,73 E. coli 0,3 4,25 2,87                     Los resultados obtenidos muestran que al igual que las StAPs el dominio StAsp-PSIr posee actividad citotóxica selectiva de manera dosis dependiente, interactuando con las membranas de microorganismos tanto patógenos de vegetales (P. infestans; F. solani) (Tabla 1A); como de humanos (Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus) (Tabla 1B); uniéndose en forma directa a la membrana plasmática; provocando cambios en la permeabilidad de la misma y subsecuentemente la muerte celular. La concentración molar a la cual ejerce su actividad microbicida es similar y en algunos casos menor a la descripta para las StAPs. Por otra parte, se pudo demostrar que dicha toxicidad es selectiva ya que en las concentraciones ensayadas no presenta citotoxicidad frente a células BY2 y eritrocitos. Discusión Al igual que muchos AMPPs, la proteína StAsp-PSIr presenta un amplio espectro de actividades antimicrobianas lo cual sugiere que la misma, al igual que las StAPs, podrían ser utilizadas en: 1-      Programas de producción vegetal para la generación de plantas transgénicas con resistencia múltiple a patógenos. 2-      Ensayos preclínicos como elementos básicos para la elaboración de nuevas drogas para el tratamiento del cáncer y/o enfermedades infecciosas. Referencias Cesari, A. et al. (2007). Fertility & Sterility. 88(4):1248-1255. Gamen, S. et al. (1998). J. Immunol. 161: 1758-1764. Gao, A. et al. (2000). Nat. Biotechnol. 18: 1307-1310. Guevara, M.G. et al. (1999). Physiol. Plant. 106: 164-169 Guevara, M.G. et al. (2001). Physiol. Plant. 112: 321-326  Guevara, M.G. et al. (2002). Eur. J. of Plant Pathol. 108: 131-137 Guevara, M.G. et al. (2004). J. Plant Pathol. 86: 235-240 Guevara, M.G. et al. (2005). Plant Physiol. Biochem. 43: 882-889. Liepinsh, E. et al. (1997). Nature Struct. Biol. 4: 793-795. Mainous III, Arch and Pomery, C. (2001). Humana Press, 349p. Mendieta, J.R. et al. (2004). BIOCELL Vol. 28 (Suppl.): 101 Mendieta, J.R. et al. (2006). Microbiology 152: 2039-2047. Muñoz, F.F. (2006). Tesis de grado. Título: Clonado, expresión y estudio de la actividad antimicrobiana del dominio PSI presente en las StAPs.UNMDP. O`Brien, J.S. and Kishimoto, Y. (1991). FASEB J 5: 301-308. Parashina, E. (2000). Rus. J. Plant Physiol. 47: 417-423. Ruysschaert, J.M. et al. (1998). FEBS Lett 425: 341-344. Selitrennikoff, C.P. (2001). Applied and Environmental Microbiology. 67: 2883-2894. Simôes, I. and Faro, C. (2004). Eur. J. Biochem. 271: 2067-2075 Stenger, S. et al. (1998). Science 282: 121-125. Terras, F.Y. et al. (1995). Plant Cell. 7: 573-588. Thevissen, K. et al. (1999). Appl. Environ. Microbiol. 65: 5451-5458. Vaccaro, A.M. et al. (1999). Neurochem. Res. 24: 307-314. Wang, Y. et al. (1999). Mol. Plant. Microb. Interact. 12: 410-418.