GTPgS, INDUCTOR DE LA REACCION ACROSOMICA, PRODUCE UN AUMENTO DEL CALCIO INTRACELULAR EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS

DOMINGUEZ LA.; FORNES MW.; BURGOS MH.; MAYORGA LS.

Mendoza

Congreso; XIV Reunión Científica Anual de la Sociedad de Biología de Cuyo; 1996

SBCUYO

La reacción acrosómica es un fenómeno exocítico que se produce por la interacción del espermatozoide con el ovocito, como uno de los pasos que lleva a la fertilización. Diversas sustancias son capaces de estimular in vitro la exocitosis acrosómica entre ellas el ión calcio, ionóforos de calcio (e.g. BrA23187) y estimuladores de proteínas G (e.g., tio-trifosfato de guanosina (GTPgS)). En estudios previos hemos propuesto la participación de una proteína G heterotrimérica (clase Go o Gi), como así también la subsecuente activación de una fosfolipasa A2 por parte de una proteína G, en la inducción in vitro de la RA. Dado que, tanto calcio como GTPgS son estimulantes de la mencionada exocitosis, resultó de interés establecer cuánto varía el calcio intracelular al estimular la RA con GTPgS. Espermatozoides humanos con parámetros normales de concentración y movilidad, obtenidos de donantes sanos, fueron separados por medio de la técnica del swimm-up. La fracción móvil de gametos se mantuvo en condiciones capacitantes durante 3 horas. A continuación, se cargaron durante 30 min con el colorante fluorescente Fura 2-AM (10uM) que permite cuantificar calcio intracelular. Posteriormente, se estimularon durante 15 min con: a) BrA23187 (10 uM), reactivo usado como control positivo que es capaz de aumentar el calcio intracelular; y b) GTPgS (40 uM), estimulante de proteínas G mono y heterotriméricas. Luego, se observaron las células en el microscopio de fluorescencia excitando con luz UV a 340 y 380 nm. La intensidad del brillo de la fluorescencia para cada espermatozoo individual, en ambas longitudes de onda, se cuantificó por medio del procesador de imágenes Image 1: Se midieron al menos30 células y los resultados se expresaron de la siguiente manera: 1) a cada valor de intensidad de la fluorescencia, para cada longitud de onda, se le restó el fondo, obteniéndose el brillo corregido; y 2) se realizó a proporción (brillo corregido a 340 nm/brillo corregido a 380 nm)* 100. El número de experimentos se indica con n. Las células tratadas con BrA23187 produjeron una proporción de intensidad de fluorescencia de 6.4% (n=4), mientras que para aquellas tratadas con GTPgS fue de 8.4% (n=3). Ambos valores fueron significativamente diferentes (p